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[目的] 鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国南方和东南亚地区高发的头颈部恶性肿瘤。众多研究证实亚硒酸钠(Sodium selenite,Na2SeO3)具有预防和治疗多种癌症的功效。本研究旨在通过探索Na2SeO3对鼻咽癌细胞株CNE-2增殖,周期及凋亡的作用效应及潜在机制,为硒应用于临床治疗肿瘤提供一定的分子依据。 [方法] 1.细胞增殖及毒性的检测: CCK8试剂盒法连续五天监测不同浓度Na2SeO3对CNE-2的增殖抑制效应。GraphPad Prism5.0软件分析Na2SeO3对CNE-2细胞的IC50,筛选后续实验药物的浓度梯度,光学显微镜下观察不同浓度Na2SeO3作用下CNE-2细胞形态学的改变。 2.细胞周期的检测:溴化丙啶单染法检测Na2SeO3对CNE-2细胞周期的影响。 3.细胞凋亡的检测:DAPI染色法及Hochest33258染色法观察凋亡细胞核的改变,荧光显微镜采集图像观察对比;琼脂糖凝胶电泳法进行DNA片段的分析;FITC-PI双染检测不同浓度Na2SeO3对CNE-2细胞凋亡率的影响。 4.细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)及细胞线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)的检测:ROS试剂盒及MMP试剂盒法,检测不同浓度Na2SeO3作用后CNE-2细胞内活性氧及细胞线粒体膜电位的改变,荧光显微镜采集图像观察对比。 5.细胞蛋白表达谱的改变:Western blotting观察各浓度Na2SeO3作用后CNE-2细胞内蛋白表达谱的变化,并使用ImageJ软件分析各种蛋白相对表达量的改变。 6.结果处理:采用Adobe Photoshop CS6软件整理图片;SPSS19.0统计软件统计分析数据,GraphPad Prism5.0软件输出图片。 [结果] 1.在2、5、10、20、50、100μmol/L的浓度范围内,连续五天的监测结果显示:Na2SeO3以时间和剂量依赖性方式抑制CNE-2细胞增殖;通过Na2SeO3对CNE-2细胞的IC50,筛选出药物后续最佳实验浓度梯度为5、10、20μmol/L;光学显微镜下观察到随着药物浓度的增加,细胞形变更加明显。 2.不同浓度(5、10、20μmol/L)Na2SeO3均能诱导CNE-2细胞发生周期阻滞,其中低浓度组(5μmol/L)诱导CNE-2细胞阻滞于S期;中浓度及高浓度(10、20μmol/L)组诱导CNE-2细胞阻滞于G0/G1期。 3.Na2SeO3处理组CNE-2细胞经DAPI及Hochest33258染液染色后,均能见到深染、固缩、碎裂的凋亡形态细胞核,且随着药物浓度增加,凋亡细胞数目明显增多;琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段观察到药物作用组出现凋亡细胞特征性DNA ladder电泳图谱;FITC-PI双染法流式细胞仪检测结果显示不同浓度Na2SeO3诱导的CNE-2凋亡率随着Na2SeO3浓度的增加而显著升高。 4.随着Na2SeO3浓度的增加,CNE-2细胞内活性氧水平逐渐升高,细胞线粒体膜电位逐渐降低;线粒体相关促凋亡蛋白Bax、Bak及caspase-3表达上调,抗凋亡蛋白Bcl-XL及PARP表达下调。 [结论] (5、10、20μmol/L)Na2SeO3抑制鼻咽癌CNE-2细胞的增殖,引起其S期或G0/G1期阻滞,并通过Bax依赖的线粒体通路诱导其凋亡。本次研究首次揭示Na2SeO3可以通过Bcl-2蛋白家族调节的线粒体途径以及下游caspase-3的激活来发挥对CNE-2细胞的抗癌作用,因此,支持Na2SeO3或可作为鼻咽癌诱导凋亡类药物的可能。