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实验目的：1.建立大鼠CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cells， Tregs）的分离和体外扩增方法，并检测分离的和扩增的Tregs纯度、活性及其免疫抑制活性。2.探讨体外扩增的Tregs静脉输注移植对大鼠缺血性脑卒中的保护作用。3.研究体外扩增的Tregs输注移植后脑缺血再灌注大鼠固有的和入侵的炎症细胞的变化，并探讨Tregs对脑缺血后神经炎症反应的抑制作用。研究方法：1.采用免疫磁珠细胞分选(Magnetic cell sorting, MACS)两步法从健康成年SD大鼠脾脏和淋巴结中提取CD4+CD25+Tregs，然后加入刺激因子anti-CD3、anti-CD28、IL-2以及雷帕霉素与之共培养进行体外扩增。用流式细胞仪测定分离的以及培养的细胞中Tregs的纯度，台盼蓝染色法检测细胞的活性，体外增殖抑制试验测定新鲜分离的和扩增的Tregs的增殖及其抑制功能。2.线栓法制备右侧大脑中动脉阻塞（MCAO）模型，缺血2h再灌注。实验大鼠随机分成假手术组、PBS处理组、脾细胞（SP）处理组和Treg细胞治疗组。在Treg细胞输注后3d、7d、14d采用Zea Longa、触须诱导的前肢放置试验、足失误试验、圆筒实验对各组大鼠进行神经功能评分；于术后2w采用水迷宫实验评价各组大鼠的空间认知能力；行TTC染色和甲酚紫染色测量脑梗死体积比以及采用干湿称重法测量脑组织含水量；免疫荧光染色法检测缺血脑组织Caspase-3的表达情况；Fluro-JadeB染色观察神经元退化情况。3.模型处理和分组同前。于Treg细胞输注后3d、14d采用免疫荧光和免疫组化染色观察MPO、Iba1、GFAP在脑组织的表达情况以检测Treg细胞输注后对中性粒细胞（MPO）向脑部的浸润以及脑固有细胞如小胶质细胞（Iba1）和星形胶质细胞（GFAP）的反应性的影响，并采用Werstern Blot方法进一步验证各组大鼠脑组织中Iba1、GFAP的表达情况。结果：1.MACS分选获得的CD4+CD25+regulatory T细胞的纯度是84.50±5.08%，细胞存活率为95.22±2.97%。经过3周体外培养扩增，Tregs的纯度为76.03±4.04%，细胞存活率为94.31±3.14%。体外增殖抑制实验表明Tregs能显著抑制CD4+CD25-T细胞的增殖（P＜0.01），体外扩增的Tregs的抑制功能超过新鲜分离的细胞，差异具有统计学意义（P＜0.05）。2.脑缺血再灌注后3d，模型组大鼠各项神经功能评分达到高峰，与PBS组和SP组相比Tregs治疗组的感觉运动功能得到显著改善。Morris Water Maze test显示在MCAO后14d，Tregs治疗组的空间学习和记忆能力较PBS组和SP组均有显著改善。TTC染色和甲酚紫染色结果显示在MCAO后不同时间点Treg治疗组的脑梗死体积较PBS和SP处理组均显著降低。在MCAO后不同时间点，Tregs治疗组的脑组织含水量较PBS和SP处理组均有明显改善；Caspase-3、Fluro-JadeB染色结果显示Tregs治疗组脑缺血半暗带区的阳性细胞数目较PBS和SP处理组显著降低。3.免疫荧光染色观察脑组织中中性粒细胞的浸润情况，结果显示假手术组无或可见少量散在分布的MPO+细胞，PBS组和SP组MPO+细胞在缺血再灌注1-3d时向脑部浸润明显，Tregs治疗组的MPO+细胞数显著降低。免疫组化和免疫荧光染色结果显示在脑缺血2w时Tregs治疗组Iba1阳性和GFAP阳性细胞数较PBS和SP处理组显著降低，WesternBlot结果与免疫组化结果一致。结论1.本实验建立的分离和扩增大鼠CD4+CD25+调节性T细胞的方法，可有效的获得高纯度、有活力且不影响其抑制功能的Treg细胞。2.扩增的CD4+CD25+Tregs治疗性输注可显著降低大脑中动脉阻塞脑缺血再灌注后脑梗死体积，降低凋亡及退化的神经元数目，并显著改善脑缺血再灌注后的神经功能损伤。3.体外培养扩增的Tregs治疗性输注可能是通过抑制外周中性粒细胞浸润以及调节小胶质细胞和星形胶质细胞的活化来介导Tregs对脑缺血再灌注的保护作用。