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研究背景:缺血和再灌注可严重破坏心肌细胞超微结构,阻碍心肌组织能量代谢,导致心肌细胞凋亡和坏死,降低缺血再灌注损伤后心肌收缩和舒张功能。预处理（缺血或药物）是目前研究最为广泛,用于减轻心肌缺血再灌注损伤的主要手段。本研究通过建立大鼠离体心脏Langendorff模型,以重组人促红细胞生成素预灌注作为处理手段,观察rhEPO预处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用;同时,通过测定磷酸化PKCε、p38MAPK和ERK1/2的表达,探讨rhEPO心肌保护的可能分子机制。第一部分促红细胞生成素预处理对大鼠缺血再灌注损伤后心功能的保护作用目的:研究rhEPO预处理对心肌缺血再灌注损伤后心肌收缩和舒张功能以及细胞活性的影响。方法:本实验采用全心缺血30分钟,再灌注120分钟模拟心肌缺血再灌注模型（I/R模型）。分别测定I/R组、rhEPO（10IU/ml）+I/R组、chelerythrine+rhEPO+I/R组、SB203580+rhEPO+I/R组、PD98059+rhEPO+I/R组、glibenclamide+rhEPO+I/R组和L-NAME+rhEPO+I/R组（共7组）缺血前、再灌注30分钟、再灌注60分钟及再灌注120分钟时的LVDP、RPP、+dP/dtmax、-dP/dtmax和CF以评测心肌收缩和舒张功能;应用MTT比色法测定各组心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞活度。结果:1.RhEPO预处理大鼠心脏再灌注30分钟的LVDP、RPP和+dP/dtmax,60、120分钟的LVDP、RPP、+dP/dtmax和CF值以及OD550均较I/R组显著升高。2.Chelerythrine和rhEPO联合预处理后,大鼠心脏再灌注30分钟的LVDP、RPP和-dP/dtmax,60、120分钟时的LVDP、RPP、±dP/dtmax以及心肌细胞活性均较rhEPO处理组显著下降。SB203580或PD98059与rhEPO联合预处理后,再灌注30分钟的LVDP、RPP和±dP/dtmax,60、120分钟的LVDP、RPP、±dP/dtmax和CF以及OD550均较rhEPO处理组显著下降。3.Glibenclamide和rhEPO联合应用后,大鼠心脏再灌注30分钟的LVDP、RPP和±dP/dtmax,60、120分钟的LVDP、RPP、±dP/dtmax和CF以及OD550均较rhEPO处理组显著下降。4.L-NAME和rhEPO联合应用后,大鼠心肌其再灌注30分钟、60分钟及120分钟的LVDP、RPP、±dP/dtmax、CF以及OD550各项指标均较rhEPO处理组显著下降。结论:RhEPO预处理能显著提高大鼠心肌缺血再灌注损伤的左心收缩和舒张功能,增加冠脉流量并提高心肌细胞存活率,其机制与PKCε、p38MAPK或ERK1/2的磷酸化激活有关,抑制PKC、p38MAPK或ERK1/2途径活化均可完全阻断rhEPO上述心肌保护作用。RhEPO预处理的心肌保护作用还与KATP通道的活化和开放有关,抑制KATP通道的开放可完全阻断rhEPO的心肌保护作用。此外,NO的合成和释放也是介导rhEPO预处理心肌保护的必要因素,阻断NOS、抑制NO的合成和释放可完全阻断rhEPO的心肌保护作用。第二部分促红细胞生成素预处理对大鼠缺血再灌注损伤的急性心肌保护的机制研究目的:探讨rhEPO预处理心肌保护的相关分子机制。方法:采用Western-blot技术分别测定对照组、rhEPO（10IU/ml）预处理、Chelerythrine+rhEPO预处理、SB203580+rhEPO预处理、PD98059+rhEPO预处理、Glibenclamidee+rhEPO预处理和L-NAME+rhEPO预处理（共7组）后心肌组织磷酸化PKCε、p38MAPK和ERK1/2的表达。结果:1.RhEPO（10IU/ml）预灌注10分钟后,心肌细胞颗粒成份（主要为线粒体、细胞核和胞膜成份）内PKCε含量较对照组显著升高,而细胞浆内PKCε含量却显著减少。同时,磷酸化p38MAPK和磷酸化ERK1/2也均较对照组显著升高。2.PKC抑制剂chelerythrine可完全阻断PKCε活化和转位,心肌细胞颗粒成份内PKcε含量较rhEPO处理组显著减少并回落至基础水平。而p38MAPK抑制剂SB203580和ERK1/2抑制剂PD98059对PKCε的活化和转位无显著影响。P38MAPK抑制剂SB203580可完全抑制磷酸化p38MAPK表达;chelerythrine可部分抑制磷酸化p38MAPK表达;而PD98059对p38MAPK磷酸化表达无显著影响。ERK1/2抑制剂PD98059可完全抑制磷酸化ERK1/2的表达;chelerythrine可部分抑制磷酸化ERK1/2的表达;而SB203580对ERK1/2的磷酸化表达无显著影响。3.广谱KATP通道抑制剂glibenclamide与rhEPO联合灌注对PKCε的活化和转位无显著影响,却能部分阻断磷酸化p38MAPK和ERK1/2的表达。4.广谱一氧化氮合酶抑制剂L-NAME与rhEPO联合灌注均能部分减少PKCε、p38MAPK和ERK1/2的磷酸化激活。结论:RhEPO（10U/ml）预灌注可快速磷酸化激活PKCε,并促使其由细胞浆向细胞颗粒成份内转移,并快速磷酸化激活p38MAPK和ERK1/2。PKCs是p38MAPK和ERK1/2的上游激酶,阻断PKCε可部分减少磷酸化p38MAPK和ERK1/2的表达。抑制KATP通道的活化和开放并不影响PKCε的活化和转位,却能部分阻断p38MAPK和ERK1/2的磷酸化表达。可见,PKCε可能是KATP通道的上游激酶;而p38MAPK和ERK1/2是KATP通道的下游激酶,p38MAPK和ERK1/2的磷酸化活化存在KATP通道依赖和非依赖途径。NOS合酶抑制剂可部分抑制PKCε的活化和转位,同时也能部分减少磷酸化p38MAPK和ERK1/2的表达。可见,PKCε、p38MAPK和ERK1/2的激活可能存在NO依赖和非依赖途径。