【摘 要】
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hTNF-α是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一,由于毒副作用较大、半衰期短、低剂量抗肿瘤效果不显著等原因限制了临床上的广泛应用,但改造后的hTNF-α
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hTNF-α是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一,由于毒副作用较大、半衰期短、低剂量抗肿瘤效果不显著等原因限制了临床上的广泛应用,但改造后的hTNF-α衍生物具有高效低毒的特点;hIFN-γ属于Ⅱ型干扰素,具有广谱的抗病毒作用,在医学临床上常用于病毒性疾病、肿瘤和自身免疫性疾病的治疗。禽类原始生殖细胞(PGCs)是配子的前体细胞,可以作为将外源基因转入基因组和生殖系的有效载体,因为PGCs能够通过血流靶向进入杂合子胚胎性索,将遗传特性直接传递给后代。如果将生殖细胞的标志基因DAZL和CVH与目的基因体内或体外共同导入PGCs,可能会提高这类细胞的生殖系传递能力,从而有助于解决转基因鸡效率低下的难题。方法:(1)从健康志愿者外周静脉血分离出淋巴细胞培养,培养液中添加脂多糖(LPS)激活巨噬细胞,用TRIzol法提取总RNA,运用RT-PCR技术克隆hTNF-α、hIFN-γ基因,并对hTNF-α基因进行突变改造;采用PCR技术从 pMD18-T-CVH、pMD18-T-DAZL 克隆鸡 CVH 和 DAZL 基因。(2)应用MultiSite Gateway技术构建卵清蛋白启动子调控的hTNF-α和hIFNγ慢病毒表达载体;构建EF1α启动子调控的CVH和DAZL慢病毒表达载体。(3)上述4个慢病毒表达载体转染293FT细胞,收集培养液,感染293FT细胞,48 h后收集细胞,以RT-PCR和western blot检测其表达。结果:(1)本实验成功克隆了 hTNF-α、hIFN-γ、CVH和鸡DAZL基因,成功构建了 pENTRTM/D-TOPO-hTNF-α、pENTR,TM/D-TOPO-hIFNγ、pENTR-D-TOPO-CVH 和 pENTRTM/D-TOPO-DAZL 四个入门载体。(2)成功构建了 pLenti6.4/OVP1 548/V5/hTNF-α、pLenti6.4/OVP1548/V5/hIFN-γ、pLenti6.4/EF1α/V5/CVH、pLenti6.4/EF1α/V5/DAZL 四个慢病毒表达载体。(3)RT-PCR 和 western blot 检测证实,hTNF-α、hIFN-γ、鸡 CVH 和 DAZL基因在293FT细胞中得以表达。本实验为进一步获得具有高生殖系传递能力,输卵管特异性表达hTNF-α、hIFN-y的转基因鸡奠定了基础。
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