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目的:
通过体内、体外实验研究明确健脾化瘀方是否可以通过调控miRNA-602/RASSFIA通路，促进肝癌细胞的凋亡，影响原发性肝癌的发生发展。
方法:
实验由两部分组成，体内实验:培养人源肝癌细胞株SMMC-7721，接种于裸鼠肝脏上建立裸鼠原位肝癌模型，7天后，小鼠成瘤后，将体内实验分为对照组、健脾化瘀方组，连续给药21天，实验期间常规观察裸鼠的一般情况，对突出体表的肿瘤做相应的记录。取材后，检测评估裸鼠肿瘤大小、肿瘤重量。收集各组裸鼠肿瘤组织，H.E染色观察各组肿瘤细胞显微镜下形态，使用qRT-PCR及Western Bolt检测小鼠肝癌组织中miR-602以及RASSFIA的mRNA及蛋白表达水平。并用Western Bolt检测肝癌组织中Casepase8、Casepase9、BAX、Bcl-2等凋亡相关分子的蛋白表达。
体外实验部分:培养人源肝癌细胞株SMMC-7721，利用MTT观察健脾化瘀方对细胞增殖的影响，并确定给药剂量，将体外实验分为对照组、健脾化瘀方低、中、高剂量组，观察显微镜下各组细胞形态的变化，采用DAPI染色及流式细胞术检测各组肝癌细胞凋亡情况。使用qRT-PCR及Western Bolt检测各种肝癌细胞中miR-602以及RASSFla的mRNA及蛋白表达水平。并用Western Bolt检测肝癌细胞中Casepase8、Casepase9、BAX、Bcl-2等凋亡相关分子的蛋白表达。
结果:
一、体内实验部分
（一）日常观察发现，原位肝癌造模后，部分裸鼠会出现肿瘤突出体表的情况。实验后期，各组裸鼠肿瘤均较前期有增大，但相对于对照组，健脾化瘀方组的裸鼠肿瘤体积明显低于对照组瘤在第12天、第15天、第18天、第21天（P＜0.05、P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01）。与此同时，我们发现相较于健脾化瘀组，对照组裸鼠在实验后期2-3只小鼠出现了恶病质表现，具有乏力、重度消瘦，拖曳而行、饮食不入的特点。而健脾化瘀组则未有裸鼠出现此改变。在体重方面，健脾化瘀方组裸鼠在第21天体重也明显高于对照组(P＜0.001)。此外，取材后测量肿瘤重量，结果显示健脾化瘀方组肿瘤组织重量明显低于对照组（P＜0.001）。
（二）HE染色检测结果显示在各组中所切除的肿块确定是癌灶，可见肿瘤细胞及周围炎性浸润。相较于对照组，健脾化瘀方组的肿瘤组织镜下显示肝癌结节较少，且炎性浸润较少，肿瘤对于正常肝窦的侵袭较弱。
（三）qRT-PCR检测各组肿瘤组织中miR-602的表达，对照组中miR-602的表达高于健脾化瘀方组（P＜0.01）。qRT-PCR、Westren bolt检测对照组中RASSF1A的mRNA表达水平及蛋白表达水平均低于健脾化瘀方组（P＜0.001、P＜0.001）。
（四）Westren bolt检测各组肝癌组织中凋亡相关分子如Casepase8、Casepase9、Bax、Bcl-2的蛋白水平表达，相较于健脾化瘀方组，对照组Casepase8、Casepase9、Bax蛋白表达水平上调（P＜0.001、P＜0.05、P＜0.001），而Bcl-2（P＜0.001）蛋白表达水平下调。
二、体外实验部分
（一）MTT检测结果表明健脾化瘀方具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，并且呈剂量依赖性（P＜0.001）。并且健脾化瘀方对于SMMC-7721细胞的IC75、IC50、IC25抑制率相对应的浓度分别为5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL。将5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL的健脾化瘀浓度定为高剂量、中剂量、低剂量。
（二）DAPI染色结果表明在健脾化瘀各组中肝癌细胞凋亡数较对照组增多，显微镜下呈现肝癌细胞核固缩，染色加深，且呈浓度依赖性。流式细胞术检测凋亡结果表明，健脾化瘀方低、中、高、肝癌细胞均凋亡率高于对照组（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001）。我们还观察到在健脾化瘀方给药48h后的肝癌细胞，相较于对照组，细胞形态出现不规则，可见细胞膜破坏，这种改变且呈剂量依赖性。
（三）qRT-PCR检测各组细胞中miR-602的表达，对照组中miR-602的表达高于健脾化瘀方低、中、高剂量组（P＜0.001、P＜0.001、P＜0001）。虽然健脾化瘀方高、中、低剂量组较对照组均显示出较高的RASSF1A的mRNA水平表达，但是健脾化瘀方高剂量组RASSF1A的mRNA水平表达具有统计学意义（P＜0.001），健脾化瘀低、中剂量组则为差异则无统计学意义。在RASSF1A蛋白水平表达方面也呈现出了相同的趋势，即健脾化瘀高剂量组相较于对照组差异有统计学意义(P＜0.05)，而健脾化瘀中剂量、低剂量组相较于对照组差异无统计学意义。
(四)Westren bolt检测各组肝癌细胞中凋亡相关分子如Casepase8、Casepase9、Bax、Bcl-2的蛋白水平表达。相较于对照组，健脾化瘀方低、中、高剂量组中Casepase8(P＜0.01,P＜0.001、P＜0.01)、Casepase9(P＜0.001、P＜0.001、P＜0.001)、Bax（P＜0.001、P＜0.05、P＜0.001）蛋白表达水平上调，而Bcl-2蛋白表达水平下调（P＜0.01、P＜0.001、P＜0.05），但这种蛋白表达水平的改变并非呈剂量依赖性。
结论:
健脾化瘀可以通过下调miR-602的表达，上调抑癌基因RASSF1A的表达，从而促进肝癌细胞的凋亡，达到抑制肝癌发生发展的目的。
通过体内、体外实验研究明确健脾化瘀方是否可以通过调控miRNA-602/RASSFIA通路，促进肝癌细胞的凋亡，影响原发性肝癌的发生发展。
方法:
实验由两部分组成，体内实验:培养人源肝癌细胞株SMMC-7721，接种于裸鼠肝脏上建立裸鼠原位肝癌模型，7天后，小鼠成瘤后，将体内实验分为对照组、健脾化瘀方组，连续给药21天，实验期间常规观察裸鼠的一般情况，对突出体表的肿瘤做相应的记录。取材后，检测评估裸鼠肿瘤大小、肿瘤重量。收集各组裸鼠肿瘤组织，H.E染色观察各组肿瘤细胞显微镜下形态，使用qRT-PCR及Western Bolt检测小鼠肝癌组织中miR-602以及RASSFIA的mRNA及蛋白表达水平。并用Western Bolt检测肝癌组织中Casepase8、Casepase9、BAX、Bcl-2等凋亡相关分子的蛋白表达。
体外实验部分:培养人源肝癌细胞株SMMC-7721，利用MTT观察健脾化瘀方对细胞增殖的影响，并确定给药剂量，将体外实验分为对照组、健脾化瘀方低、中、高剂量组，观察显微镜下各组细胞形态的变化，采用DAPI染色及流式细胞术检测各组肝癌细胞凋亡情况。使用qRT-PCR及Western Bolt检测各种肝癌细胞中miR-602以及RASSFla的mRNA及蛋白表达水平。并用Western Bolt检测肝癌细胞中Casepase8、Casepase9、BAX、Bcl-2等凋亡相关分子的蛋白表达。
结果:
一、体内实验部分
（一）日常观察发现，原位肝癌造模后，部分裸鼠会出现肿瘤突出体表的情况。实验后期，各组裸鼠肿瘤均较前期有增大，但相对于对照组，健脾化瘀方组的裸鼠肿瘤体积明显低于对照组瘤在第12天、第15天、第18天、第21天（P＜0.05、P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01）。与此同时，我们发现相较于健脾化瘀组，对照组裸鼠在实验后期2-3只小鼠出现了恶病质表现，具有乏力、重度消瘦，拖曳而行、饮食不入的特点。而健脾化瘀组则未有裸鼠出现此改变。在体重方面，健脾化瘀方组裸鼠在第21天体重也明显高于对照组(P＜0.001)。此外，取材后测量肿瘤重量，结果显示健脾化瘀方组肿瘤组织重量明显低于对照组（P＜0.001）。
（二）HE染色检测结果显示在各组中所切除的肿块确定是癌灶，可见肿瘤细胞及周围炎性浸润。相较于对照组，健脾化瘀方组的肿瘤组织镜下显示肝癌结节较少，且炎性浸润较少，肿瘤对于正常肝窦的侵袭较弱。
（三）qRT-PCR检测各组肿瘤组织中miR-602的表达，对照组中miR-602的表达高于健脾化瘀方组（P＜0.01）。qRT-PCR、Westren bolt检测对照组中RASSF1A的mRNA表达水平及蛋白表达水平均低于健脾化瘀方组（P＜0.001、P＜0.001）。
（四）Westren bolt检测各组肝癌组织中凋亡相关分子如Casepase8、Casepase9、Bax、Bcl-2的蛋白水平表达，相较于健脾化瘀方组，对照组Casepase8、Casepase9、Bax蛋白表达水平上调（P＜0.001、P＜0.05、P＜0.001），而Bcl-2（P＜0.001）蛋白表达水平下调。
二、体外实验部分
（一）MTT检测结果表明健脾化瘀方具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，并且呈剂量依赖性（P＜0.001）。并且健脾化瘀方对于SMMC-7721细胞的IC75、IC50、IC25抑制率相对应的浓度分别为5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL。将5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL的健脾化瘀浓度定为高剂量、中剂量、低剂量。
（二）DAPI染色结果表明在健脾化瘀各组中肝癌细胞凋亡数较对照组增多，显微镜下呈现肝癌细胞核固缩，染色加深，且呈浓度依赖性。流式细胞术检测凋亡结果表明，健脾化瘀方低、中、高、肝癌细胞均凋亡率高于对照组（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001）。我们还观察到在健脾化瘀方给药48h后的肝癌细胞，相较于对照组，细胞形态出现不规则，可见细胞膜破坏，这种改变且呈剂量依赖性。
（三）qRT-PCR检测各组细胞中miR-602的表达，对照组中miR-602的表达高于健脾化瘀方低、中、高剂量组（P＜0.001、P＜0.001、P＜0001）。虽然健脾化瘀方高、中、低剂量组较对照组均显示出较高的RASSF1A的mRNA水平表达，但是健脾化瘀方高剂量组RASSF1A的mRNA水平表达具有统计学意义（P＜0.001），健脾化瘀低、中剂量组则为差异则无统计学意义。在RASSF1A蛋白水平表达方面也呈现出了相同的趋势，即健脾化瘀高剂量组相较于对照组差异有统计学意义(P＜0.05)，而健脾化瘀中剂量、低剂量组相较于对照组差异无统计学意义。
(四)Westren bolt检测各组肝癌细胞中凋亡相关分子如Casepase8、Casepase9、Bax、Bcl-2的蛋白水平表达。相较于对照组，健脾化瘀方低、中、高剂量组中Casepase8(P＜0.01,P＜0.001、P＜0.01)、Casepase9(P＜0.001、P＜0.001、P＜0.001)、Bax（P＜0.001、P＜0.05、P＜0.001）蛋白表达水平上调，而Bcl-2蛋白表达水平下调（P＜0.01、P＜0.001、P＜0.05），但这种蛋白表达水平的改变并非呈剂量依赖性。
结论:
健脾化瘀可以通过下调miR-602的表达，上调抑癌基因RASSF1A的表达，从而促进肝癌细胞的凋亡，达到抑制肝癌发生发展的目的。