研究背景目前皮肤移植仍然是救治大面积深度烧伤、严重创伤的关键措施之一,对于大面积深度烧伤的患者来说,能否尽早地封闭创面关系到其预后。尽早封闭创面可以减少创面渗出和体液、营养物质的流失,降低感染发生的几率,缩短治疗时间以及减轻患者的痛苦及经济压力,提高病患的存活率及其以后的生活质量。封闭皮肤缺损创面的最好方法是自体皮肤移植,但是大面积烧伤或创伤常常会造成患者自身皮肤来源严重缺乏,无法满足烧伤所致大面积皮肤缺损的需要,这也是导致重度烧伤患者残疾或死亡的最重要因素。异种或同种异体皮肤移植虽然可以暂时解决创面的短期覆盖问题,但是由于皮肤是抗原性最强的组织之一,机体对移植物具有强烈的免疫排斥反应,致使皮肤移植后存活时间较短。异种或同种异体皮肤移植后机体对移植物的排斥反应在治疗效果方面是消极的。免疫抑制剂用于治疗器官移植排斥反应,可明显延长移植物存活时间,但是免疫抑制剂具有显著的副作用,长期使用免疫抑制剂可导致器官损伤,降低机体的抗感染和抗肿瘤能力,导致急性感染甚至癌症,所以免疫抑制剂的应用受到限制。另外,大面积烧伤的患者常伴有全身感染,这种情况下免疫抑制剂也是慎重应用的。因此,如何在不应用免疫抑制剂的前提下延长异种或异体皮的存活时间是目前比较棘手的问题。在这种情况下,诱导免疫耐受便显得尤为重要,移植耐受性是同种异体移植物在没有应用免疫抑制剂的情况下移植物保持稳定功能而未被受体排斥,但对第三方的免疫反应保持完整。对于大面积烧伤患者,如果在不应用免疫抑制剂的前提下采用异种或同种异体皮肤封闭其创面而不发生免疫排斥反应,达到免疫耐受的状态,不仅能够尽早使创面愈合,减轻其经济压力,还能减少瘢痕挛缩所造成的畸形,提高患者的生活质量。因此如何诱导这种免疫耐受是组织器官移植研究道路上亟需解决的问题。目前间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)是医学研究的一大热点。MSCs是一群中胚层来源的具有多向分化潜能和自我更新能力的成体干细胞,在组织再生和修复医学中有着十分广阔的应用前景。MSCs可以从成体多种组织,如脂肪、骨髓、滑膜、牙髓、胎盘、羊水、脐带血、胎肺、胎肝甚至经血中分离获得,其分离方法简便,体外扩增迅速、方便,且不涉及伦理问题,这使得MSCs成为细胞治疗首选的种子细胞。另外MSCs已被广泛证实具有免疫调节作用,虽然机制尚不明确,但由于其具有明确的免疫抑制和诱导免疫耐受的作用,促使众多学者将MSCs应用于诱导同种异体移植免疫耐受的研究当中,并显示MSCs在治疗自身免疫性疾病及器官移植领域具有巨大的潜能。2002年,B artholomew A等研究发现单纯输注异基因甚至第三方的MSCs可以延长狒狒的皮肤移植物存活时间,为解决异种或异体皮肤移植排斥提供了新的选项。之后,Lee SM等人研究显示:条件培养基或脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cell,ADSCs)输注与对照组相比可明显延长同种异体移植皮肤的存活时间,并指出ADSCs及其分泌的细胞因子具有诱导免疫耐受的可能性。大量关于预处理的MSCs用以提高其在免疫抑制作用和诱导免疫耐受能力的研究实验正在如火如荼的开展着。相关研究表明,MSCs结合基因转染、药物或细胞因子处理的方法可能提高其诱导免疫耐受的能力。例如,Bian L等实验结果显示肝细胞生长因子转染的MSCs可明显延长大鼠同种异体移植皮肤的存活时间。Zhang Y等实验证实与未处理的MSCs相比,Stro-1(+)MSCs可以大大延长大鼠皮肤移植物的存活时间。白介素17(interleukin-17,IL-17)主要由Th17细胞分泌产生,另外还可产生于NKT(natural killer T)细胞和中性粒细胞等固有免疫细胞,其不仅在免疫活化中起到重要作用,而且还参与了肿瘤、感染免疫以及免疫性疾病的进程,如自身免疫性肝炎等。IL-17还具有诱导细胞分化,促进多种细胞因子和趋化因子的释放,招募中性粒细胞的作用,在炎症疾病中,其水平在组织和血清中会明显增高,因此被认为是最强有力的炎症细胞因子之一。但是有意思的是最近多项研究发现IL-17可增强MSCs的免疫抑制作用,而非促进炎症的发生、逆转MSCs的免疫抑制作用。本实验拟通过将IL-17预处理的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)注射至同种异体皮肤移植模型小鼠体内,探讨IL-17增强BMSCs诱导异体皮肤移植免疫耐受能力并延长同种异体皮肤存活时间的可行性。研究目的通过白介素17对骨髓间充质干细胞抑制淋巴细胞增殖作用影响的体外实验以及白介素17对骨髓间充质干细胞诱导同种异体皮肤移植免疫耐受影响的动物实验,检验并证实BMSCs是否具有诱导免疫耐受,延长受体小鼠移植皮肤存活时间的作用,探讨IL-17可否增强BMSCs诱导免疫耐受并延长同种异体皮肤移植的皮肤存活时间,通过该实验初步探索IL-17增强BMSCs免疫抑制作用而达到诱导免疫耐受的机制。研究方法1.BMSCs的分离,培养和鉴定脊椎脱臼法处死Balb/c小鼠,分离双侧股骨、胫骨和肱骨,体外通过冲洗股骨、胫骨和肱骨骨髓腔,从中分离骨髓细胞,过滤细胞悬浮液后,离心,吸弃上清液,用所配制的低糖DMEM完全培养液重悬后在5%CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中培养。通过其多向诱导分化的能力和表面标志性抗原检测来鉴定BMSCs:BMSCs常规培养,待细胞达90%融合时,分别进行成骨、成软骨和成脂培养,成骨、成软骨和成脂诱导及相应对照组分别以茜素红S、阿利辛蓝及油红O染料进行着色鉴定。BMSCs进行体外培养,当细胞达到80%融合时消化,离心弃上清,磷酸盐缓冲液(phosphatic buffer solution,PBS)洗涤2遍后重悬制成5×105个细胞/ml的细胞悬液,分装至样品管中,分别加入抗小鼠单克隆抗体Anti-CD31-FITC,Anti-CD117-FITC 及Anti-CD29-FITC,Anti-CD44-FITC,放置于4℃冰箱,避光孵育30分钟;离心、洗涤,流式上机检测。2.IL-17对BMSCs的预处理取BMSCs 2×105个接种于25cm2培养瓶中,24小时后更换培养基,将IL-17加入培养基中(终浓度为50ng/ml)。每天观察处理后的BMSCs的形态及生长趋势。5天后去除培养基,胰酶消化收集IL-17预处理的BMSCs(BMSCs pretreated with IL-17,BMSCs-17)用于实验。3.淋巴细胞增殖抑制实验胰酶消化收集BMSCs、BMSCs-17,10%FBS的DMEM低糖完全培养基重悬,计数,将之调节并获取不同的细胞浓度的BMSCs、BMSCs-17,各取100微升与100微升的刀豆蛋白A(concanavalinA,ConA)刺激后的脾淋巴细胞在96孔板中共培养,用MTT法检测淋巴细胞的增殖情况。4.BMSCs 的CM-Dil 标记CM-Dil用质量浓度为100%的DMSO溶解制成1.0m g/mL工作液并过滤。取第4-8代融合度为90%的BMSCs,在25cm2培养瓶中加人5 μg/mL CM-Dil溶液(由5μL工作液溶于1 mL PBS制得)2～3 mL。37℃,5%CO2孵育处理5min,4℃下孵育20min;吸弃CM-DiI溶液,加入10%FBS低糖DMEM完全培养基继续培养,观察其生长状态及传代后荧光标记情况。5.异体皮肤移植模型的建立麻醉BALB/C小鼠,俯卧位固定小鼠四肢,在供体背部获得全层皮肤,并修剪成大小为1.5×1.5 cm2全厚皮片置于生理盐水纱布中备用。在受体C57BL/6J小鼠麻醉后俯卧位固定四肢,在其背部人为形成1.5×1.5 cm2的皮肤缺损区,将BALB/C小鼠全厚皮片植于C57BL/6J小鼠背部创面上,留长线备打包,创面依次油纱,棉球覆盖,打包固定,单笼饲养。6.细胞输注与实验分组体外扩增培养BALB/C小鼠BMSCs,取第4-8代生长状态良好的细胞进行实验。实验组用IL-17预处理的BALB/C小鼠BMSCs。于术前一天自C57BL/6J尾静脉注射BALB/C小鼠BMSCs后进行异体皮肤移植。移植后5天打开包堆观察移植皮肤成活情况及体内免疫状态的变化。将C57BL/6J小鼠随机分为3组:①实验分组如下:A组尾静脉注射PBS,异体皮肤移植;B组尾静脉注射MSCs,异体皮肤移植;C组尾静脉注射BMSCs-17,异体皮肤移植。7.BMSCs的CM-DiI示踪将CM-Dil标记后的BMSCs以及BMSCs-17沿C57BL/6J小鼠尾静脉注入体内后行异体皮肤移植,于术后第7天切取移植物行冰冻切片,冷丙酮固定,抗荧光衰减封片剂封片后,荧光显微镜下观察BMSCs去向。8.移植皮肤的外观及组织学观察于术后第5天打开包堆后开始观察C57BL/6J小鼠移植皮肤的外观,并同时记录各组各只小鼠移植皮肤的存活时间。皮肤如果有90%结痂则定义为坏死,如果移植皮肤完全发黑、变硬并脱落定义为排斥;于术后第7天取C57BL/6J小鼠移植皮肤行HE染色光镜下观片。9.受体小鼠脾脏调节性T细胞的检测移植术后第7天取受体C57BL/6J小鼠脾脏制备单细胞悬液,用小鼠Regulatory T Cell试剂盒按其说明书步骤检测术后受体C57BL/6J小鼠调节T细胞(T regulation cells,Treg cells)细胞的含量。10.受体C57BL/6J小鼠细胞因子(IL-10、IFN-γ、TGF-β)的检测应用摘眼球法在术后第7天采取受体C57BL/6J小鼠静脉血,室温静置10-20min,2000-3000rpm离心20min,仔细收集上清,置于-20℃保存。按照IL-10、IFN-γ、TGF-βELISA试剂盒说明书的步骤检测小鼠IL-10、IFN-γ、TGF-β含量。结果1.BMSCs贴壁生长,呈梭形,极性排列,旋涡状。BMSCs具有多向分化的潜能,可以在特定的分化培养基中分化为成脂细胞、成骨细胞和成软骨细胞;BMSCs高表达表面抗原CD29(99.24%)和CD44(99.67%),而不表达造血干细胞表面特异性抗原CD31(0.35%)和CD117(0.27%)。2.在体外实验中,BMSCs能够显著抑制T淋巴细胞增殖(经ConA刺激增殖),而不受主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)的限制,另外,这种抑制作用随着BMSCs细胞浓度的增加而增强。3.各检测及观察指标结果如下:(1)移植皮片的存活时间对照组为11.8±0.834天,BMSCs组为15.8±0.783天,BMSCs-17组存活时间明显延长至19.2±1.012天。BMSCs-17组的存活时间明显长于对照组(P<0.001)和 BMSCs 组(P<0.01)。(2)移植物外观及HE染色术后第12天移植皮肤的外观:对照组约2/3的移植皮肤发黑坏死,部分结痂,BMSCs组移植皮肤大部分存活良好,仅少量出现发黑、坏死,BMSCs-17组移植皮肤成活良好,无发黑、坏死,甚至毛发正常生长。HE染色显示,对照组有大量炎性细胞浸润、脱落和无血管生成,BMSCs组有少量炎性细胞浸润和血管生成,BMSCs-17组炎性细胞浸润少,血管生成多。(3)BMSCs示踪IL-17预处理后,更多的BMSCs定植于移植物,经IL-17处理后BMSCs向植皮区归巢的数量增加。(4)受体Treg亚群比例皮肤移植术后第7天,对照组Treg亚群比例明显低于其他两组(P<0.001),BMSCs-17组Treg亚群比例明显高于其他两组(P<0.001)。(5)受体血清中细胞因子含量:对照组TGF-β、IL-10明显低于其他两组(p<0.001),BMSCs-17 组 TGF-β、IL-10 均显著高于 BMSCs 组(p<0.001);对照组 IFN-γ明显高于 BMSCs 组和 BMSCs-17 组(p<0.001),BMSCs-17 组 IFN-y明显低于BMSCs组(p<0.001)。结论1.BMSCs贴壁生长,具有多向分化的潜能,可以在特定的分化培养基中分化为成脂细胞、成骨细胞和成软骨细胞,并特异性表达相关表面抗原。2.通过脾淋巴细胞增殖抑制实验说明IL-17显著增强了BMSCs对淋巴细胞增殖的抑制作用。3.IL-17通过增强BMSCs免疫抑制的作用以及其归巢能力,来诱导受体免疫耐受,最终达到减轻移植后免疫排斥反应,延长移植组织或器官存活时间的结果。意义皮肤作为全身免疫原性最强的器官之一,如果能解决皮肤移植免疫耐受的问题或者延长异体移植皮肤的存活时间,那这种方法理论上也可以应用到别的器官移植中,减轻甚至消除免疫排斥反应,达到稳定的免疫耐受状态,这对于器官移植来说具有深远的意义。因此我们将“IL-17可以增强BMSCs的免疫抑制作用”的理论应用到同种异体皮肤移植的模型中来探讨IL-17是否能够增强BMSCs免疫抑制作用而达到诱导免疫耐受,继而延长移植皮肤的存活时间。不足之处本实验对“IL-17增强BMSCs的免疫抑制作用”的更深层次的作用机制仍需进一步实验探明,相信该机制对临床采用IL-17联合BMSCs治疗自身免疫性疾病及器官移植排异等会有较好的治疗价值,未来我们将持续对这些机制进行研究。