论文部分内容阅读
一氧化氮(NO)是介导植物细胞次生代谢产物合成的一种重要信号分子。近年来的研究发现,NO可以通过蛋白质巯基亚硝基化调控植物氧化还原、信号转导和代谢等多种生理过程。本研究室前期的研究发现,NO、亚硝基硫醇(RSNO)和蛋白质巯基亚硝基化介导了白桦悬浮细胞或白桦幼苗中三萜的累积,但介导其合成的蛋白巯基亚硝基化靶蛋白还未明确。为此,本论文从RSNO入手,分析日周期变化、去亚硝基化途径抑制剂和BpZFP9基因表达对RSNO含量、白桦三萜含量和BpZFP9基因表达的影响。主要研究结果如下:BpZFP1～BpZFP10的基因表达在NO供体硝普纳(SNP)处理的白桦悬浮细胞和亚硝基谷胱甘肽还原酶(GSNOR)基因沉默的白桦植株中的趋势基本相同,其中响应程度最高的基因为BpZFP7和BpZFP9;同样处理下,羽扇豆醇合酶(BpLUS,三萜关键酶之一)基因表达量显著增加。由此可见,NO和RSNO显著提高了BpZFP7、BpZFP9和BpLUS基因的表达量。3个连续日周期下白桦成熟叶片中BpZFP9基因表达量和RSNO含量分别在18:00和3:00达到峰值;BpGSNOR基因表达量、还原型谷胱甘肽含量日变化趋势呈“单峰”状,均在21:00时达到峰值;三萜含量的日变化呈“梯”状,在18:00～6:00期间持续维持在较高的同一水平;BpSS、BpLUS和BpCAS等三萜合成关键酶基因的表达量也在18:00～6:00期间达到最高值。由此可见,白桦三萜含量、RSNO含量与BpZFP9基因表达趋势基本一致。将去亚硝基化途径关键酶GSNOR与硫氧还蛋白的抑制剂N6022、金诺芬(ARF)和SNP分别处理白桦悬浮细胞发现,与对照相对,N6022、ARF和SNP分别处理后,RSNO含量均显著高于对照;进一步分析等处理发现,BpZFP9基因表达、RSNO和三萜含量均呈增加趋势,而BpGSNOR基因表达呈降低趋势。由此推测,ZFP9蛋白亚硝基化介导了白桦三萜的合成。构建BpZFP9基因的过表达和沉默载体,瞬时侵染白桦叶片结果表明,BpLUS与BpZFP9基因表达趋势相同。获得具有卡那抗性的BpZFP9基因过表达的稳定白桦转基因株系220株,鉴定其中100株系,PCR验证得到17个阳性株系,分析其中BpZFP9基因过表达的2个株系,发现BpLUS基因表达量也呈上调趋势。综上,我们推测BpZFP9蛋白亚硝基化可能介导了白桦三萜的合成。