小尾寒羊是世界上具有非季节性发情和多胎特性的高繁殖力绵羊品种之一,揭示小尾寒羊多胎的分子生物学调控机制,无论对于小尾寒羊的选育及有效利用,还是弄清绵羊排卵率多样性产生的分子基础,并选择准确、直观的标记以用于MAS(Marker assisted selection)均具有重要的理论意义和应用价值。本文分别以BMPR-IB和BMP15作为小尾寒羊产羔数性状的候选基因,利用PCR-RFLP方法检测这两个基因的突变情况,对含突变位点的序列进行克隆和测序,并对突变可能造成的调控机制的变化进行预测,研究突变位点与小尾寒羊产羔数性状的相关性,寻找与小尾寒羊多胎性能有关的主效基因,结果发现该品种在BMPR-IB基因的相应位置上发生了与Booroola Merino羊相同的突变(A746G),且针对该突变点进行大规模群体检测时,发现在小尾寒羊群体中该点的突变率较高,达到73.5%,而在单胎品种滩羊群体中未发现突变个体。BMPR-IB位点B等位基因在多胎品种小尾寒羊群体内的频率优势和在单羔品种滩羊群体中的零频率反映出其对繁殖性能具有显著影响作用。通过遗传效应分析,小尾寒羊初产和经产母羊的BB基因型比++基因型分别多产0.97羔(p<0.05),和1.5羔(p<0.01)。这表明,BMPR-IB这个影响Booroola Merino羊排卵数的基因在小尾寒羊中亦存在相同的作用。故可以推测BMPR-IB基因可能是控制小尾寒羊多胎性能的主效基因或是与之存在紧密连锁的标记。本研究在小尾寒羊群体中未检测到BMP15的V31D和Q23Ter突变,这说明小尾寒羊的多胎遗传机制与Romney羊不同,因此排除了BMP15基因突变影响小尾寒羊排卵数的可能性。本文对另一个与排卵有关的FSHR基因5’端转录启动调控区进行了克隆和分析。通过对小尾寒羊、滩羊和澳洲绵羊FSHR基因的15个转录调控元件序列进行比较,结果不同品系羊之间没有任何差异。说明绵羊元件序列的保守性较强,排除了因转录调控元件突变而影响FSHR基因转录调节能力的可能性。本文采用SMART技术在国内外首次成功构建了高质量的小尾寒羊卵巢组织cDNA文库。该文库的原始容量为5×106,重组率达到96%以上,扩增后库的滴度达1(109 pfu/ml,文库中插入片段大小分布在0.5～5.0kb之间,平均长度为1.5kb左右。随机挑选了380个样品进行测序,共测序968次。通过拼接得到338个ESTs,这些ESTs均具有3’端Poly (A)结构,测序的成功率为88.9%。通过聚类分析将所有ESTs归为191个<WP=11>contig,其中大于2kb的contig有7个,介于2kb和1kb中间的有69个,它们共占contig总数的39.8%。Cluster归类,191条EST中表达频率=1的基因148条,占独立基因总数的77.49%,视为低丰度表达基因;2≤表达频率≤5的基因33条,占独立基因总数的17.28%,视为中丰度表达基因;表达频率>5的基因12条,占独立基因总数的6.28%,视为高丰度表达基因。通过同源性分析发现了许多绵羊发情期卵巢组织特异表达的基因和没有同源匹配序列的新基因。191个ESTs序列中在GenBank和EMBL中未找到匹配同源序列的ESTs为89个;88个EST在人类、牛及鼠等物种中可以找到同源序列,且功能明确,其中只有9个在GenBank的绵羊数据库中可以找到同源序列;另外14个EST虽然找到同源序列,但功能尚不清楚。本文首次探索性地引入DDRT-PCR技术,对多胎品系的小尾寒羊和单胎品系的滩羊卵巢组织影响排卵率的mRNA差异表达的展示进行研究。利用正交法优化反应条件,一次PCR反应即可确定无同位素的银染差异显示最佳反应条件。通过应用三条锚定引物和八条随机引物,共计24个引物组合,并经过反向Northern杂交印证排除假阳性,最终获得24条小尾寒羊卵巢组织差异表达条带。通过BLAST对这些EST进行同源序列搜索,结果有5个EST以多拷贝形式存在,13个EST为单拷贝。18个EST中检索到有编码区且功能已知同源序列的EST有6条,检索到同源序列但无编码区或功能未知的EST有3条,没有匹配序列的新EST有9条。进一步分析表明这些EST分别代表NOS2、tensin、TCRA 、CDKN1A 、ESR1、ACTB 等基因,显然这些基因在小尾寒羊中是特异表达的,至于是否与排卵率相关尚待研究。本文还首次利用DD-PCR技术研究卵泡的发育分化过程中不同阶段之间基因的差异表达。从剥离的有腔卵泡中筛选直径>5mm的大卵泡归为一组,将直径<3mm的有腔小卵泡归为另一组,然后对两组卵泡进行mRNA差异显示。通过初步的差异显示和反向Northern杂交验证,我们获得35条与卵泡发育密切相关的表达基因片断,其中12条在直径>5mm大卵泡中特异表达,23条在直径<3mm的有腔小卵泡特异表达。通过测序和BLAST搜索,有腔小卵泡特异表达的基因有:ESR1、TPTC1、XIST、MTIc、 phosphatidylinositol-3-phosphate associated protein、ODC、RBBP4和C6orf69等;大卵泡特异表达的基因有:SLC25A5、SCRN1、FLJ14775和COL11A1等以及部分未知基因。这表明不同的卵泡发育阶段存在着不同基因表达的差异。这些结果既丰富了GenBank中有限的绵羊EST资源数据库。又为寻找影响小尾寒羊高排卵率的新的候选基因提供了依据。 <WP=12>本研究在前期成功构建小尾寒羊卵巢组织cDNA文库的基础上,利用最新的生物信息数据资料,采用同源克隆的策略,以已知其他物种与排卵率相关基因片段标记的探针对小尾寒羊发情期卵巢组织cDNA文库进行筛选、克隆,获得小尾寒羊卵?