论文部分内容阅读
组蛋白修饰是研究较早和最多的表观遗传调控机制之一。在细胞中,不同的组蛋白修饰酶可以根据细胞内功能所需,对组蛋白N端尾巴上的特定氨基酸位点进行不同的修饰包括乙酰基化、甲基化、泛素化和磷酸化等,从而改变染色质结构的疏密程度并进一步改变基因的转录、染色质重组和DNA损伤修复等生物学过程。人源MOF(Males absent on the first)是MYST组蛋白乙酰基转移酶家族成员之一,是果蝇MOF蛋白的直系同源,参与细胞内多种重要的生物过程。已有研究报道,MOF作为催化亚基,参与组成MSL(Male-specific lethal)和NSL(Non-specific lethal)两个组蛋白乙酰基转移酶复合物,都具有催化组蛋白H4K16ac的酶活性,提示这两种复合物可能在某些功能上具有一定的相似性。另一方面,由于参与组成两个复合物的亚基组分不同,又导致二者在催化底物和生物学功能上的特异性。例如,在人细胞中,MSL复合物由MOF和MSL1-3四个亚基组成,并特异地乙酰化组蛋白H4K16位点;而NSL复合物则由包括MOF和NSL1-3等在内的九个亚基组成,与MSL复合物相比具有更广泛的底物特异性,可以同时乙酰化组蛋白H4K5、K8和K16多个位点。但是,目前有关MSL和NSL复合物在生物学功能上的异同点研究报道甚少。为了深入探讨这两种复合物在人细胞中的生物学功能,我们利用基因编辑技术结合多组学高通量数据分析以及一系列生化实验,研究了含MOF复合物对细胞上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)进程以及侵袭转移的影响。首先,我们分别在MSL和NSL复合物中选择能够影响复合物全酶活性的关键亚基MSL1和NSL3,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统成功构建了分别敲除MSL1(MSL1-KO)和NSL3(NSL3-KO)的HEK293T细胞株,结合Ch IP-Seq实验及其生物信息统计分析发现,MSL复合物主要参与维护细胞的正常生长,而NSL复合物更多的参与调控多种信号传导通路。有趣的是,MSL1和NSL3敲除在常光显微镜下都可以引起一些细胞形态的改变。其次,利用细胞活力检测、细胞克隆形成实验、流式细胞分析和细胞免疫荧光染色等实验,我们还证实这两种敲除细胞株对细胞的增殖、周期和骨架等的影响截然不同。MSL1-KO能够促进细胞存活和克隆形成,使细胞周期阻滞在G2/M和S期,并引起纺锤体多极化改变。相反,NSL3-KO则能抑制细胞存活和克隆形成,细胞周期阻滞在S期,并产生管腔样细胞的形态变化。以上结果提示,这两种复合物可能以不同的分子机制参与维护正常细胞的增殖、周期和分裂过程。在Transwell实验中,敲除或敲低MSL1导致HEK293T或乳腺癌细胞(MCF-7和MDA-MB-231)的迁移能力显著增强;而敲除或敲低NSL3则抑制HEK293T或乳腺癌细胞的迁移能力,表明这两种复合物反向调控细胞的迁移能力。蛋白质免疫印迹实验结果进一步证实了这一结论。MSL1敲除或敲低降低上皮生物标志物E-cadherin的蛋白水平,而间充质生物标志物如N-cadherin、Vimentin和Snail的蛋白水平明显增加。而NSL3敲除或敲低则导致完全相反的结果,即E-cadherin蛋白水平增高,N-cadherin、Vimentin和Snail的蛋白水平降低。以上结果表明,MSL和NSL复合物都与EMT进程相关,但是其调控的分子机制不同。最后,通过构建EMT相关因子包括E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail的双荧光素酶报告基因质粒和荧光素酶活性检测,我们进一步证实MSL复合物,而不是NSL复合物,可以特异性结合到含有E-box的Snail基因启动子区域,负调控Snail基因的转录激活。后续进一步通过小鼠荷瘤实验证实沉默MSL1基因表达能够促进裸鼠MCF-7细胞异种移植瘤的生长和小鼠B16F10黑色素瘤细胞的肺转移。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9介导的MSL1和NSL3敲除HEK293T细胞株以及sh RNA/si RNA干扰技术,结合一系列生物学实验,证实了含MOF组蛋白乙酰基转移酶MSL和NSL两种复合物以不同的分子机制参与EMT进程。在正常情况下,MSL可能作为肿瘤抑制因子,特异性结合到含有E-box基序的Snail基因启动子区域,从而抑制Snail基因的表达和EMT进程。但是,当MSL复合物功能缺陷时,可引起细胞形态的改变、并诱导EMT进程,从而促进肿瘤细胞的侵袭转移。与MSL复合物相反,正常情况下,NSL复合物可能有助于细胞增殖,而当功能受损时则抑制细胞增殖和EMT进程。我们的数据为阐明含MOF的NSL和MSL两种复合物在人细胞中的作用及其分子机制提供了新的见解。