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近年来,经生殖道传播和感染人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)呈逐年上升趋势。HPV感染,尤其是高危型(主要包括16、18型等)感染是引起阴道、宫颈尖锐湿疣并最终导致阴道癌、宫颈癌的主要病因,近100%的宫颈癌、癌前病变及鳞状上皮病变中含有HPV-DNA,HPV感染已成为全球关注的重大健康问题。HPV感染引发机体抑制特异性免疫应答特别是细胞免疫,不能有效清除病毒,从而导致感染持续存在。清除HPV感染,尤其是高危型HPV,不仅可以减少性传播疾病的发生,还可明显降低相关肿瘤的发病率。目前临床广泛采用的治疗方法多是去除疣体和/或非特异性的免疫治疗方法,在短期内可能有一定的疗效,但不能彻底有效清除细胞内的病毒,也不能有效控制疾病复发。为了弥补目前治疗方法的不足,治疗性疫苗已成为抗HPV及相关肿瘤生物治疗研究的热点。以往研究表明:细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)介导的特异性细胞免疫在机体抗感染和抗肿瘤中起重要作用。因此有效激发特异性CTL应答是治疗性疫苗的重要目标。CTL通过其T细胞受体特异性识别抗原提呈细胞(antigen-presenting cells,APCs)(如肿瘤细胞)表面的主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex,MHC)-I类分子-肽复合物,然后自身得以活化,并最终通过多种机制杀死靶细胞。本论文中的HPV治疗性疫苗VR111是利用人乙型肝炎病毒核心蛋白(HBcAg)能够自动形成病毒样颗粒(VLPs)的特性,将HPV16 E7蛋白及Hsp65蛋白与之融合表达,形成嵌合的病毒样颗粒,而嵌合的病毒样颗粒具有较强的抗原递呈细胞(如树突状细胞)靶向性,可以增强HPV16 E7蛋白的免疫原性,特别是刺激产生细胞免疫活性,从而清除体内被HPV感染的细胞,达到治疗相关疾病的目的。本论文旨在研究该治疗性疫苗的抗肿瘤作用,并进一步探求其作用机制。本论文主要包括两部分内容:第一部分,HPV治疗性疫苗VR111在模型动物体内的药效学评价。第二部分,研究该治疗性疫苗VR111抗肿瘤的作用机理。第一部分观察的指标主要包括肿瘤体积和生存时间。结果显示疫苗VR111在TC-1小鼠肿瘤模型中表现出显著的抗肿瘤作用且存在明显的正相关量效关系。VR111抗肿瘤作用主要表现在以下几个方面:一、显著抑制肿瘤的生长,多次研究结果重现性良好,疫苗的抑瘤率最高可以达到80%以上;二、提高肿瘤模型动物的存活率;三、延长模型动物的生存时间。结果证明VR111与顺铂联用可大大提高抗肿瘤作用,两者具有明显的协同作用。肿瘤抑瘤率为94.4%;至给药后40天,该动物的生存率为90%。第二部分分五个小节。第一节:疫苗VR111促淋巴细胞免疫活化作用。本节采用3H-TDR掺入法研究了疫苗VR111及其它对照组分的促脾淋巴细胞增殖活性;采用ELISA法研究了疫苗及其它对照组分促脾淋巴细胞细胞因子分泌活性。疫苗VR111能够显著促进淋巴细胞的增殖,不同剂量组的SI(增殖指数)分别为10.8±2.2,24.0±1.0,31.8±3.7,存在一定的剂量效应关系,即随剂量增加,促淋巴细胞增殖活性逐渐增加;HSP-E7融合蛋白也存在较强的促淋巴细胞增殖作用;其它各组药物对淋巴细胞的促增殖相对活性较弱,增殖指数无显著性差异。疫苗VR111可以显著增加脾淋巴细胞促TH1型细胞因子(IL-2与IFN-γ)的诱导表达,在研究剂量内存在明显的量效关系。疫苗VR111对脾淋巴细胞分泌的TH2型细胞因子(IL-4与IL-10)的表达无影响。E7可以增加IFN-γ的诱导表达增加,但对白介素家族(IL-2、IL-4、IL-10)的表达无显著作用。HSP-E7可以同时显著增加IL-2及IFN-γ的表达水平,水平高于E7组。提示HSP可以促进淋巴细胞的活化,诱导TH1细胞因子的分泌,但对TH2型细胞因子无显著影响。三个组分(HSP、E7、HBcAg)的混合物未观察到诱导淋巴细胞活性增加(细胞因子表达活性)。第二节:疫苗VR111对CD8+T细胞免疫活性的影响。本节主要采用流式细胞术检测脾淋巴细胞经VR111刺激后CD8+T细胞数量的变化以及采用ELISPOT检测了疫苗VR111对CD8+T细胞促IFN-γ分泌活性的影响。结果显示给予疫苗刺激后发现CD8+T细胞所占脾淋巴细胞的比例随着刺激剂量的增加而逐渐降低,而HSP-E7组却没有显著的变化。VR111能够明显促进CD8+T细胞的IFN-γ分泌能力,且存在明显的剂量依赖性。其中,铝佐剂可以明显提高VR111刺激淋巴细胞促IFN-γ分泌能力。第三节:CD4+T细胞以及CD8+T细胞在VR111体内抗肿瘤作用中的作用研究。本节主要采用抗体分别敲除动物体内的CD4+T细胞以及CD8+T细胞以研究CD4+T细胞和CD8+T细胞在抗肿瘤作用中所处的地位。结果表明CD8+ T细胞在疫苗抗肿瘤过程中发挥极其重要的作用,而CD4+ T细胞对于VR111发挥抗肿瘤没有明显的作用。第四节:细胞毒性T淋巴细胞(CTL)体内外的肿瘤杀伤作用。本节主要采用51Cr释放法研究脾淋巴细胞对肿瘤细胞TC-1的杀伤活性以及采用过继性CTL传输实验研究CTL的体内抗肿瘤作用。结果显示疫苗VR111可以通过激活CTL细胞杀伤肿瘤细胞,从而发挥抗肿瘤作用。第五节:VR111及其它对照组分的免疫原性研究,本节主要采用ELISA检测免疫动物体内的抗体水平。结果显示VR111可以显著提高体液免疫水平,提高体内的抗体水平,在一定时间内,高滴度的抗体水平可以维持在较高的水平。综上所述,本课题取得的主要进展如下:1)HPV治疗性疫苗VR111具有显著的抗肿瘤作用:可以显著抑制肿瘤的生长;提高肿瘤模型动物的存活率;延长模型动物的生存时间。2)HPV治疗性疫苗VR111与化疗药物顺铂联用可显著提高在模型小鼠中的抗肿瘤作用。3)HPV治疗性疫苗VR111可以显著促进机体的细胞免疫应答,通过促进淋巴细胞的增殖活化特别是CD8+T的活化,促使其分化成为CTL,从而发挥抗肿瘤作用。4)HPV治疗性疫苗VR111可以显著促进体液免疫应答,其可能与疫苗预防肿瘤发生相关,但其在抗肿瘤中的作用及机理还有待后续进一步研究。