目的糖尿病肾脏疾病(Diabetic kidney disease,DKD)是由糖尿病引起的肾脏微血管并发症,其特征为蛋白尿以及进行性肾功能损伤,DKD是导致终末期肾脏病的主要原因之一。由于DKD给个人家庭和社会带来了沉重的经济负担,因此它是全球范围内的主要公共卫生问题。近年来,国内由DKD引起的终末期肾脏疾病的比例每年都会增加。因此,探究DKD发病机制并寻求其有效治疗方法在减轻家庭和社会的经济负担以及解决社会公共卫生问题等方面,具有重要社会意义和经济价值。DKD发病机制非常复杂,目前尚未完全阐明,涉及到高血糖、炎症、氧化应激和血流动力学改变等因素。高血糖和氧化应激在DKD疾病致病机制中起到关键作用,一方面可以诱导激活多条与细胞增生、肥大相关信号通路,并造成DKD早期肾脏肥大等特征性病理改变。另一方面,氧化还原应激状态和高血糖都会导致线粒体蛋白和线粒体DNA氧化损伤以及线粒体自噬,从而造成其功能损伤,促进DKD的进展。蒿甲醚是由中药青蒿提取物青蒿素衍变而来,近年来的研究表明蒿甲醚不仅对不同类型肿瘤细胞的增殖具有抑制作用,也发现其对代谢性疾病具有一定治疗作用。但是,蒿甲醚对1型DKD的作用及其机制并未见有报道。因此本研究基于前期的研究基础,以链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)诱导的1型糖尿病动物模型和体外细胞实验两个方面,目的在于探讨:(1)蒿甲醚对STZ诱导的1型糖尿病小鼠是否具有肾脏保护作用;(2)蒿甲醚对1型糖尿病相关症状是否有改善作用;(3)蒿甲醚是否可以改善1型糖尿病肾脏肥大及其作用机制;(4)蒿甲醚是否可以改善1型糖尿病的肾脏线粒体功能及其作用机制。方法1、动物实验以STZ诱导的糖尿病小鼠为研究对象,按照随机数字表法将其分为正常对照组(即T1D-ctr1组)、糖尿病组(即STZ组)和蒿甲醚干预组(即STZ+Art)。T1D-ctr1和STZ组小鼠给予标准饲料喂养,STZ+Art组给予含药物饲料(蒿甲醚/饲料:0.67g/kg)喂养,蒿甲醚开始治疗时设置为0周点,共计用药干预8周。使用小鼠代谢笼留取0、4、8周点各组小鼠24h尿液,同时采集24h饮水量、尿量、进食量及粪便量数据;用药后每周点称量各组小鼠体重并使用血糖仪测定空腹血糖。药物干预8周后,留取各组小鼠全血、血清、胰腺、肾脏等标本。使用ELISA试剂盒测定小鼠尿白蛋白排泄率、NGAL、Kim-1和血清胰岛素;使用生化法检测小鼠尿糖结果;采用PAS染色观察小鼠肾脏形态学变化并测量计算出肾小球血管袢面积、肾小球毛细血管袢体积、系膜基质面积、肾小管面积、肾小管管腔和管壁面积;应用电镜检测各组小鼠肾小球和肾小管基底膜厚度以及足突宽度;在HE染色下,计数胰腺内的每个胰岛的个数并测量每个胰岛面积;使用激光共聚焦显微镜检测并计算胰岛内α、β和δ细胞阳性面积比例;使用Amplex UltraRed检测肾脏线粒体H202释放速率;使用免疫组化法检测肾组织中catalase、SOD2、p-Erk1/2和p-S6RP的分布情况;使用荧光定量PCR方法检测肾组织中catalase、SOD2、PDH、MPC1和PDK1的相对表达量;使用 western blot 法检测肾组织中 PDK1、PGC-1 α、catalase、SOD2、p-Erk1/2、p-MEK1/2、p-S6RP、p70S6K、p-Akt、p-mTOR、p-p27kip蛋白含量,同时检测肾脏线粒体蛋白中PDK1的蛋白表达水平。2、细胞实验以大鼠肾小管上皮细胞系(Normal rat kidney epithelial cells,NRK-52E)为研究对象,通过给予高浓度葡萄糖刺激NRK-52E细胞活性增加,通过MTT法检测细胞活性;给予蒿甲醚干预24h、48h、72h后,通过MTT法检测细胞活性;通过western blot检测蒿甲醚对mTOR/p70S6K信号通路的作用。结果1、动物实验(1)蒿甲醚可以显著降低STZ小鼠尿蛋白排泄率并减轻肾脏重量;(2)蒿甲醚可以改善STZ小鼠肾脏肥大性病理改变,减少肾小球血管袢面积和体积、肾小球系膜区面积、减少肾小球基底膜厚度和足细胞足突宽度、肾小管及其管腔和管壁面积、肾小管基底膜厚度;(3)蒿甲醚可以降低STZ小鼠空腹血糖和糖化血红蛋白水平,降低尿糖水平并改善其多饮、多食、多尿症状;(4)蒿甲醚可以改善STZ小鼠胰岛内α、β和δ细胞比例失衡,增加血清胰岛素浓度;(5)蒿甲醚可以降低 STZ 小鼠肾组织中 p-Erk1/2、p-MEK1/2、p-S6RP、p70S6K、p-Akt、p-mTOR、p-p27kip 蛋白含量;(6)蒿甲醚可以降低STZ小鼠肾脏线粒体中PDK1的蛋白表达量,同时可以降低肾组织中PDK1蛋白水平以及PDK1的mRNA相对表达量,增加肾组织中PDH、MPC1的mRNA相对表达量,以及增加肾组织中PGC-1 α蛋白水平;(7)蒿甲醚可以增加STZ小鼠肾组织中catalase、SOD2蛋白浓度及catalase、SOD2 mRNA相对表达量;(8)蒿甲醚可以增加STZ小鼠肾组织线粒体中H2O2释放速率。2、细胞实验(1)不同浓度葡萄糖刺激下,NRK-52E细胞活性提升,并呈一定时间依赖性;(2)蒿甲醚可明显抑制高糖刺激的NRK-52E细胞活性;(3)蒿甲醚可以下调高糖干预24h、48h以及72h的NRK-52E细胞中S6RP、p70S6K、和mTOR蛋白磷酸化水平,在48h最为明显。结论本研究首次验证了蒿甲醚对STZ诱导的1型糖尿病小鼠具有肾脏保护作用,能够改善STZ小鼠的糖尿病症状,降低1型糖尿病小鼠尿白蛋白排泄率,减轻肾脏病理损伤。蒿甲醚对糖尿病肾脏的保护作用可能以下因素有关。(1)蒿甲醚能增加STZ小鼠胰岛素的分泌,降低血糖;(2)蒿甲醚能调节糖尿病小鼠肾脏内氧化应激反应,抑制Akt/mTOR/p70S6K和MAPK/Erk信号通路的活化;(3)蒿甲醚能通过改善1型糖尿病肾脏线粒体对丙酮酸的摄取和氧化能力从而提升了线粒体功能。