N-乙酰神经氨酸（NeuAc）是一种常见的唾液酸,在自然界多种植物、动物和微生物中广泛存在,可用于合成其他唾液酸或者唾液酸的衍生物。NeuAc主要存在于细胞表面糖链末端,参与维持生物大分子的结构,进行细胞信号识别等重要的生理功能。NeuAc作为保健食品和药品,商业价值很高。目前,NeuAc的生产方式以酶法合成和全细胞催化为主,但这两种方法均需要外源添加昂贵的前体物。因此亟需开发一种利用葡萄糖等廉价碳源高效合成NeuAc的微生物细胞工厂。本实验室前期构建了一株以葡萄糖为唯一碳源生产NeuAc的工程化大肠杆菌,通过理性代谢工程改造、筛选合成途径关键酶并提高其溶解度等策略优化了 NeuAc的生物合成。但仍存在代谢不平衡,如关键前体物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）供应不足及中间产物N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）的大量积累,限制了产量的进一步优化。为了提高NeuAc的生产,避免中间产物GlcNAc的大量积累,因乙酰葡萄糖胺-2-异构酶（Age）催化GlcNAc生成前体物N-乙酰甘露糖胺（ManNAc）,论文首先设计提高Age的活性,我们对Age的三个关键位点Ala172、Glu218、Asn236进行组合突变,同时对Cys370位点进行饱和突变,以试图提高Age的催化活性。比较突变体的产量发现突变株C370A、C370N、C370M产量较高,其中C370A的NeuAc产量相较于野生型提高了 34%。由于中间产物GlcNAc积累的问题仍然存在,因此尝试引入催化UDP-GlcNAc合成ManNAc的异构酶（NeuC）,在现有合成途径上构建NeuC依赖的NeuAc新途径,该改造未达到预期效果。另外,为解决NeuAc合成的另一瓶颈即PEP前体供给不足的问题,前期曾敲除PEP代谢途径上的关键酶防止PEP被代谢,但该改造却导致了大量丙酮酸积累,产量和菌株生长均被严重抑制,推测是由于对菌株的代谢改造过于刚性而导致菌体代谢严重不均衡。由于大肠杆菌糖酵解的代谢刚性,果糖1.6-二磷酸（FBP）会前馈激活pykF的活性,因此我们设计丙酮酸激酶pykF的Lys382、Arg431进行点突变,来解除前馈激活,降低其酶活性,减少PEP的消耗。发酵结果显示突变体K382Q菌株虽然产量与出发菌株相差不大,但糖酸转化率要高于出发菌株,且具有更好的菌株稳定性,这表明pykF活性的降低对于PEP的积累是有效的。丙酮酸浓度的稳定对于PEP的积累至关重要,开发响应丙酮酸的生物传感器以动态调控PEP代谢途径中的关键基因是维持丙酮酸稳态的前提下高水平积累PEP的理想策略。首先,我们在大肠杆菌体内开发了响应中心代谢产物丙酮酸的激活型生物传感器,并通过更换启动子强度、增加结合位点数量、过表达结合蛋白等方式对丙酮酸激活型生物传感器的表达强度和动力学范围进行优化和调整。同时,我们通过反义转录的方式实现丙酮酸激活型生物传感器的信号转换,构建了丙酮酸抑制型生物传感器并将其应用于NeuAc生产中,对PEP代谢途径中的相关基因（pykF、ptsG、gltA、zwf、ppc、pck）进行动态抑制,最终动态抑制ptsG的菌株在摇瓶分批补料发酵144 h后获得了 25.4 g/L的NeuAc,产量相较于出发菌株提高了 32%,为目前以葡萄糖为碳源从头合成NeuAc的摇瓶发酵最高产量。综上所述,本论文基于NeuAc生产的现状,通过改造关键酶Age的关键位点,提高了其催化效率。同时,在大肠杆菌中开发并表征了响应中心代谢产物丙酮酸的生物传感器,并将其应用于对PEP代谢途径中关键基因的动态调控,最终达到了减少副产物积累并增加NeuAc产量的目的,为微生物合成NeuAc时如何平衡前体物PEP在生产和代谢之间的通量提供了范例和思路。