【摘 要】
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目的:宫颈癌作为全球女性癌症中第二大杀手,在2000年全球新发病例数为46.8万,在2020年达到60万例,HPV作为宫颈癌的主要病因,目前已有针对HPV的疫苗上市,其中九价HPV疫苗对宫颈癌的预防能力最高,但在疫苗知识不易普及的地区及群体中,宫颈癌的发生不能得到较早的诊断和治疗,HPV 16型阳性宫颈癌占50%以上。miRNA在癌症中被发现多靶向关键基因发挥作用,本研究我们关注miR-154-5
【基金项目】
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国家自然科学基金青年项目“miR-154靶向CUL2调控HPV16 E7-pRb途径在宫颈癌发生中的作用（编号:81702583）”；
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目的:宫颈癌作为全球女性癌症中第二大杀手,在2000年全球新发病例数为46.8万,在2020年达到60万例,HPV作为宫颈癌的主要病因,目前已有针对HPV的疫苗上市,其中九价HPV疫苗对宫颈癌的预防能力最高,但在疫苗知识不易普及的地区及群体中,宫颈癌的发生不能得到较早的诊断和治疗,HPV 16型阳性宫颈癌占50%以上。miRNA在癌症中被发现多靶向关键基因发挥作用,本研究我们关注miR-154-5p在不同宫颈组织中的表达情况,并通过芯片信息与生物信息学方法挖掘出与miR-154-5p相关可作为其靶点的基因。E3泛素连接酶中的CUL2由于在蛋白降解中起着至关重要的作用,已被发现参与肿瘤发生和病毒感染等过程,CUL2在宫颈癌中的表达与诊断中表现出促癌作用。在此基础之上,进一步研究miR-154-5p/CUL2对裸鼠体内宫颈癌生长的作用,并在尾静脉转移模型中探索其对肿瘤侵袭能力的影响,为以miR-154-5p/CUL2为轴的子宫颈癌治疗提供体内实验依据。方法:一、检测miR-154-5p在不同宫颈癌组织的表达筛选在山西医科大学第二医院阴道镜检查的患者中单一 HPV 16型阳性的97例宫颈组织,包括慢性宫颈炎24例、LSIL 23例、HSIL23例和SCC 27例。提取组织中的总RNA,采用qRT-PCR技术检测miR-154-5p的相对表达量。二、CUL2是miR-154-5p的靶基因收集2019年1月至2020年1月的7对宫颈癌组织与癌旁组织,利用芯片测序技术,探索差异mRNA的表达谱,在生物信息学网站（Targetscan,miR BD,Encori）中筛选可与miR-154-5p结合的mRNA,通过对靶向mRNA功能与表达的确定,锁定了 CUL2为其中的关键靶基因。利用慢病毒转染技术对SiHa细胞建立稳定过表达miR-154-5p 细胞组（miR-154-5p-OE）、稳定沉默 miR-154-5p 细胞组（miR-154-5p-SP）,以转染慢病毒空载体为作为对照组（miR-154-5p-CO）。检测CUL2在各组细胞中的表达水平。三、miR-154-5p靶向CUL2调控裸鼠体内宫颈鳞癌细胞的生长与转移通过裸鼠皮下移植瘤实验,在4-6周龄的Balb/c雌性裸鼠皮下分别注射miR-154-5p-OE、miR-154-5p-SP和miR-154-5p-CO组的SiHa稳转细胞株,观察移植瘤生长情况;利用qRT-PCR、western blot和免疫组化法检测移植瘤CUL2表达量的变化,判断miR-154-5p对肿瘤中CUL2表达水平的影响;建立尾静脉转移模型,选取1-6周龄的Balb/c雌性裸鼠,在鼠尾静脉中注射带有GFP的SiHa稳转细胞株,采集可能转移脏器的信号值,观察对比癌细胞在体内的转移情况。并通过体内功能回复实验验证miR-154-5p通过靶向CUL2产生对宫颈癌的影响。结果:1.与对照组HPV16+炎性宫颈组织相比,HPV16+的LSIL、HSIL和宫颈癌组织中miR-154-5p的表达均显著降低。2.利用芯片信息筛选宫颈癌组织与癌旁组织中差异表达的mRNA,miR-154-5p的38个靶基因中与泛素蛋白酶体系统相关;结合生物信息学网站预测结果显示,预测miR-154-5p与CUL2具有相互作用关系。3.CUL2在GEPIA组织表达谱中显示,与正常的宫颈组织相比,宫颈癌中的表达量相对较高;基因芯片信息中也呈现CUL2在癌中表达水平较高;CUL2在宫颈癌中具有一定的诊断预测能力。4.与对照组相比,miR-154-5p低表达促进SiHa细胞中的CUL2表达,而miR-154-5p过表达抑制CUL2的表达。5.体内实验结果显示为miR-154-5p低表达促进裸鼠体内宫颈癌的生长与转移;相反,miR-154-5p过表达可抑制SiHa细胞在体内的生长与转移;CUL2的过表达可逆转miR-154-5p在体内对宫颈癌生长的抑制。结论:在本研究中,我们发现miR-154-5p与HPV 16感染致宫颈癌病变的发展相关,通过生物信息学分析,确定了 miR-154-5p的靶基因CUL2在宫颈癌中起到了促癌作用。在裸小鼠体内证实了 miR-154-5p可靶向CUL2抑制宫颈癌发生发展的生物学功能,因此miR-154-5p和CUL2可能作为宫颈癌发展的潜在预测指标。
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