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目的:弱视的发生对儿童视力影响很大，若不采取及时的治疗将会导致终身视力缺陷。目前国内外临床上多采用左旋多巴(L-dopa)治疗弱视，文献报道其已取得了一定的成功。然而，左旋多巴治疗存在外周副作用较大、耐受性差、药效波动等缺点。鉴于早期实验，本课题组已经合成新型的左旋多巴衍生物左旋多巴甲酯(LDME)。本研究的目的是观察不同剂量的LDME对剥夺性弱视猫模型的影响，评价其治疗弱视的主要药效学作用，并探讨LDME的可能作用机制。
方法:初生家养幼猫(2-4wk)30只随机分为6组(每组5只):左旋多巴甲酯高剂量组(LDMEH)、中剂量组(LDMEM)、低剂量组(LDMEL)、阳性药L-dopa对照组、正常对照组(NC)、弱视模型对照组(AM)。除了正常组外，于4wk时参照Hubel经典实验方法对各组幼猫进行麻醉后的左眼单纯上下睑缝合建立剥夺性弱视。12周后经图形视觉诱发电位(P-VEP)确定形成弱视后,灌胃给与左旋多巴甲酯20,40,80mg·kg-1，阳性对照组给与左旋多巴40mg·kg-1，正常对照组及模型组均给与等量生理盐水。每天一次持续30天。
①应用图形视觉诱发电位(P-VEP)研究左旋多巴甲酯对各组猫视皮质电生理的影响;②进行HE染色、Niss1染色和透射电镜观察左旋多巴甲酯给药组猫视皮质17区形态学的变化;③TUNEL检测法观察视皮质17区神经细胞的凋亡情况;④免疫组织化学法检测视皮质17区中神经生长因子(NGF)、c-Fos的表达;⑤Western-blot法检测视皮质17区中NGF、c-Fos蛋白的表达。⑥荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测视皮质17区中c-fosmRNA的表达。
结果:
1、视觉电生理研究
P-VEP结果显示，弱视模型组(AC)中剥夺眼表现为波幅值明显降低及P100值潜时延长的特征，与同侧正常对照眼比较，差异具有统计学意义(P＜0.01)。与弱视模型组比较，药物治疗各组弱视眼P100值潜时逐渐缩短，其中LDMEH最为明显，差异有统计学意义(p＜0.05andp＜0.01);同时药物治疗各组弱视眼振幅有不同程度的升高，有显著性差异(p＜0.05andp＜0.01)。提示LDME能有效地改善剥夺性弱视猫弱视眼的信号传导功能。
2、视皮质17区的形态学研究
弱视模型组(AC)视皮层17区的神经元形态表现为解剖和生理上的损伤。而经L-dopa和LDME治疗后，各组视皮层17区的神经元逐渐修复和再生，表现为Niss1小体和神经细胞数量的增加。
3、LDME对弱视猫模型视皮质17区细胞凋亡表达的影响
弱视模型组中，神经元细胞发生了严重的DNA链断裂情况，表现为TUNEL阳性细胞数量较多。与模型对照组比较，给药各组的视皮层17区神经元凋亡细胞计数均有不同程度的减少。其中LDMEH表现出明显的抗凋亡的作用，差异有统计学意义(P＜0.01)。给药各组都对弱视眼视皮质17区神经细胞有着一定程度的逆转细胞凋亡作用，差异均有统计学意义(P＜0.05andP＜0.01)。
4、LDME对弱视猫模型视皮质17区神经生长因子(NGF)表达的影响
与弱视模型组比较，治疗各组(包括阳性对照组、左旋多巴甲酯高、中、低剂量组)NGF免疫阳性细胞数量在各层有所增加，层间的差异有统计学意义(P＜0.01andP＜0.05)。与L-dopa对照组比较，同剂量给药的LDMEM中NGF阳性细胞数多于L-dopa阳性组，提示LDME发挥了较好的治疗作用，但LDMEM低于LDMEH和正常对照组，差异均未见统计学意义。Westernblot分析显示，弱视模型组NGF蛋白的表达明显少于其他各组(P＜0.01)。而各治疗组中的NGF蛋白的表达逐渐增加。
5、LDME对弱视猫模型视皮质17区c-fosmRNA表达的影响
FQ-PCR表明，正常组猫视皮层c-fosmRNA表达水平活跃。与正常对照组相比较，弱视模型组弱视猫视皮层c-fosmRNA表达水平明显下调，差异有显著性(P＜0.01)。与弱视模型组相比，治疗各组(包括L-dopa和LDME)c-fosmRNA表达水平逐渐上调，差异有统计学意义(P＜0.01)，而其中LDMEH表达最为明显(P＜0.01)。
6、LDME对弱视猫模型视皮质17区c-Fos蛋白表达的影响
弱视对照组视皮层17区中c-Fos阳性细胞较少表达，与正常组比较其密度明显降低，差别有统计意义(P＜0.01或P＜0.05)。其中LDMEH阳性细胞密度高于弱视对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)。但与正常对照组比较，LDMEH的c-Fos免疫阳性细胞密度在各层均少于正常组对照组，两者间未见有统计学差异。Westernblot分析显示，弱视模型组c-Fos蛋白的表达明显少于其他各组(P＜0.01)。而各治疗组中c-Fos蛋白的表达逐渐增加。
结论:
①左旋多巴甲酯明显缩短剥夺性弱视猫P100波峰潜时和提升P100波幅值，故其具有改善剥夺性弱视猫的信号传导而恢复视觉功能的作用。
②左旋多巴甲酯治疗具有恢复形觉剥夺弱视视皮质神经元修复、再生能力，促进髓鞘结构髓磷脂的合成进而增强神经冲动的传导并更好地保护髓鞘。
③左旋多巴甲酯对弱视视皮层17区的神经细胞有效地进行抑制凋亡进程。
④左旋多巴甲酯治疗对于形觉剥夺性弱视猫视皮质17区神经细胞NGF表达的上调与神经细胞数量的增加(尼氏小体数量的增加)、P-VEP中各波值的改善效果相一致。
⑤左旋多巴甲酯有效促进剥夺性弱视猫视皮质17区c-fosmRNA水平的上调。
⑥左旋多巴甲酯有效增加剥夺性弱视猫视皮质17区c-Fos蛋白的表达。
⑦左旋多巴甲酯有效恢复视皮质17区的功能并可作为弱视治疗的潜在药物。左旋多巴甲酯治疗弱视的机制可能与其调控视皮质17区NGF、c-fos的表达而抑制细胞凋亡进程以及促进神经元修复、再生有关。
方法:初生家养幼猫(2-4wk)30只随机分为6组(每组5只):左旋多巴甲酯高剂量组(LDMEH)、中剂量组(LDMEM)、低剂量组(LDMEL)、阳性药L-dopa对照组、正常对照组(NC)、弱视模型对照组(AM)。除了正常组外，于4wk时参照Hubel经典实验方法对各组幼猫进行麻醉后的左眼单纯上下睑缝合建立剥夺性弱视。12周后经图形视觉诱发电位(P-VEP)确定形成弱视后,灌胃给与左旋多巴甲酯20,40,80mg·kg-1，阳性对照组给与左旋多巴40mg·kg-1，正常对照组及模型组均给与等量生理盐水。每天一次持续30天。
①应用图形视觉诱发电位(P-VEP)研究左旋多巴甲酯对各组猫视皮质电生理的影响;②进行HE染色、Niss1染色和透射电镜观察左旋多巴甲酯给药组猫视皮质17区形态学的变化;③TUNEL检测法观察视皮质17区神经细胞的凋亡情况;④免疫组织化学法检测视皮质17区中神经生长因子(NGF)、c-Fos的表达;⑤Western-blot法检测视皮质17区中NGF、c-Fos蛋白的表达。⑥荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测视皮质17区中c-fosmRNA的表达。
结果:
1、视觉电生理研究
P-VEP结果显示，弱视模型组(AC)中剥夺眼表现为波幅值明显降低及P100值潜时延长的特征，与同侧正常对照眼比较，差异具有统计学意义(P＜0.01)。与弱视模型组比较，药物治疗各组弱视眼P100值潜时逐渐缩短，其中LDMEH最为明显，差异有统计学意义(p＜0.05andp＜0.01);同时药物治疗各组弱视眼振幅有不同程度的升高，有显著性差异(p＜0.05andp＜0.01)。提示LDME能有效地改善剥夺性弱视猫弱视眼的信号传导功能。
2、视皮质17区的形态学研究
弱视模型组(AC)视皮层17区的神经元形态表现为解剖和生理上的损伤。而经L-dopa和LDME治疗后，各组视皮层17区的神经元逐渐修复和再生，表现为Niss1小体和神经细胞数量的增加。
3、LDME对弱视猫模型视皮质17区细胞凋亡表达的影响
弱视模型组中，神经元细胞发生了严重的DNA链断裂情况，表现为TUNEL阳性细胞数量较多。与模型对照组比较，给药各组的视皮层17区神经元凋亡细胞计数均有不同程度的减少。其中LDMEH表现出明显的抗凋亡的作用，差异有统计学意义(P＜0.01)。给药各组都对弱视眼视皮质17区神经细胞有着一定程度的逆转细胞凋亡作用，差异均有统计学意义(P＜0.05andP＜0.01)。
4、LDME对弱视猫模型视皮质17区神经生长因子(NGF)表达的影响
与弱视模型组比较，治疗各组(包括阳性对照组、左旋多巴甲酯高、中、低剂量组)NGF免疫阳性细胞数量在各层有所增加，层间的差异有统计学意义(P＜0.01andP＜0.05)。与L-dopa对照组比较，同剂量给药的LDMEM中NGF阳性细胞数多于L-dopa阳性组，提示LDME发挥了较好的治疗作用，但LDMEM低于LDMEH和正常对照组，差异均未见统计学意义。Westernblot分析显示，弱视模型组NGF蛋白的表达明显少于其他各组(P＜0.01)。而各治疗组中的NGF蛋白的表达逐渐增加。
5、LDME对弱视猫模型视皮质17区c-fosmRNA表达的影响
FQ-PCR表明，正常组猫视皮层c-fosmRNA表达水平活跃。与正常对照组相比较，弱视模型组弱视猫视皮层c-fosmRNA表达水平明显下调，差异有显著性(P＜0.01)。与弱视模型组相比，治疗各组(包括L-dopa和LDME)c-fosmRNA表达水平逐渐上调，差异有统计学意义(P＜0.01)，而其中LDMEH表达最为明显(P＜0.01)。
6、LDME对弱视猫模型视皮质17区c-Fos蛋白表达的影响
弱视对照组视皮层17区中c-Fos阳性细胞较少表达，与正常组比较其密度明显降低，差别有统计意义(P＜0.01或P＜0.05)。其中LDMEH阳性细胞密度高于弱视对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)。但与正常对照组比较，LDMEH的c-Fos免疫阳性细胞密度在各层均少于正常组对照组，两者间未见有统计学差异。Westernblot分析显示，弱视模型组c-Fos蛋白的表达明显少于其他各组(P＜0.01)。而各治疗组中c-Fos蛋白的表达逐渐增加。
结论:
①左旋多巴甲酯明显缩短剥夺性弱视猫P100波峰潜时和提升P100波幅值，故其具有改善剥夺性弱视猫的信号传导而恢复视觉功能的作用。
②左旋多巴甲酯治疗具有恢复形觉剥夺弱视视皮质神经元修复、再生能力，促进髓鞘结构髓磷脂的合成进而增强神经冲动的传导并更好地保护髓鞘。
③左旋多巴甲酯对弱视视皮层17区的神经细胞有效地进行抑制凋亡进程。
④左旋多巴甲酯治疗对于形觉剥夺性弱视猫视皮质17区神经细胞NGF表达的上调与神经细胞数量的增加(尼氏小体数量的增加)、P-VEP中各波值的改善效果相一致。
⑤左旋多巴甲酯有效促进剥夺性弱视猫视皮质17区c-fosmRNA水平的上调。
⑥左旋多巴甲酯有效增加剥夺性弱视猫视皮质17区c-Fos蛋白的表达。
⑦左旋多巴甲酯有效恢复视皮质17区的功能并可作为弱视治疗的潜在药物。左旋多巴甲酯治疗弱视的机制可能与其调控视皮质17区NGF、c-fos的表达而抑制细胞凋亡进程以及促进神经元修复、再生有关。