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牙鲆（Paralichthys olivaceus）是鱼类典型的变态模式生物,其在生长阶段需要经过一个剧烈的变态过程,尤其是右眼左移和生活方式由浮游型转变为底栖型,使得牙鲆视觉感光系统发生适应性改变。甲状腺激素（Thyroid Hormone,TH）通过与甲状腺激素受体（Thyroid Hormone Receptor,TR）结合诱导牙鲆仔鱼的变态过程,进一步加快视觉感光转导系统的适应性改变。在视觉感光转导系统中发挥着至关重要作用的磷酸二酯酶PDE6s在眼睛中特异性表达。PDE6s是一个四聚体复合物,主要分布在视杆和视锥两种感光细胞中;在视锥细胞的抑制亚基和催化亚基的分别由pde6h和pde6c基因编码,视杆细胞抑制亚基由pde6g基因编码。此外,PDE6s上游基因gnat2是介导光传导的第一步,PDE6s下游基因cngb3是介导光传导的最后一步。MicroRNA（miRNA）也是牙鲆变态过程中重要的调控因子对靶基因进行转录后调控,并且受到甲状腺激素的调控。因此,本研究以视觉转导通路的5个靶基因作为研究对象,TH和miRNA作为调控因子,利用RT-qPCR技术和双荧光素酶报告实验,初步揭示TH、视觉转导级联反应、miRNA三者在牙鲆变态过程中视觉转导级联反应中的相互作用关系,为进一步研究鱼类视觉转导系统奠定了基础。本研究具体的研究内容如下:1.视觉转导相关基因在牙鲆组织和变态期中的表达利用RT-qPCR技术检测了视觉转导相关基因在牙鲆成鱼组织、仔鱼变态期以及在TH、TU处理组和拯救组中的表达量。组织表达谱的结果显示:pde6h、pde6c、pde6g、gnat2和cngb3这5个基因均在眼睛中高表达,表明这几个基因在视觉中具有重要的作用。变态时期的结果显示:pde6h、pde6c、pde6g和gnat2这4个基因在牙鲆变态后期表达水平显著上调,而cngb3在变态过程中表达水平显著下调。TH和TU处理组的结果显示:在TH和TU作用下,这5个基因均呈现无规律上调或者下调,但在整个变态过程中,TH对pde6h,pde6c,pde6g以及在变态中期和后期对gnat2和cngb3具有显著的正向调控作用;而TU在整个变态期,对pde6h,pde6c,pde6g以及在变态后期对gnat2均具有显著的负向调控作用,在整个过程中对cngb3具有正向调控作用。拯救组的实验结果表明:在TU+TH和TU+NC组中的牙鲆仔鱼可以被拯救过来继续完成变态的过程;此外,这5个基因在TU+TH和TU+NC组的表达量均显著上调,表明了TH对这5个基因具有调控作用。2.TRαA和TRβ受体及gnat2对PDE6s调控关系的验证根据TRE位点序列对pde6h、pde6c和pde6g启动区进行分析,结果表明:pde6h基因的启动子区含有1个DR4类型的TRE位点和5个半TRE位点;pde6c基因的启动子区含有2个T3R转录因子的结合位点和1个半TRE位点;pde6g基因的启动子区含有4个半TRE位点。分别将3个基因包含TRE位点的启动子序列构建到p GL3-basic载体上,与内参质粒及p3x Flag-TRαA或p3x Flag-TRβ共转到293T细胞中,添加外源性T3,双荧光素酶报告结果显示:T3可以通过TRαA正向调控pde6h和pde6c启动转录活性;T3可以通过TRβ负向调控pde6g启动转录活性。当T3作用于TRαA和TRβ两个受体时,pde6c和pde6g的启动转录活性强于单个受体的作用,但pde6g没有差异显著性,pde6h启动转录活性显著低于单个受体的作用效果;以上结果表明pde6h、pde6c和pde6g均是T3的靶基因。此外,将gnat2基因构建到pc DNA3.1上,分别与三个基因的启动子及内参质粒共转,双荧光素酶报告结果显示:gnat2对pde6h和pde6c具有正向调控作用,但对pde6g没有调控作用。3.视觉转导相关基因与miRNA靶向关系的验证利用靶基因在线预测软件分别对pde6h、pde6c、pde6g、gnat2和cngb3基因3’UTR区与miR-21/miR-124/miR-193/miR-199/let-7e/let-7i根据预测原则进行靶结合位点的预测,结果显示:pde6h和pde6c分别和6个miRNA均有结合位点;pde6g分别与miR-21、miR-193、let-7e和let-7i有结合位点;gnat2分别和miR-199、let-7e和let-7i有结合位点;cngb3分别和miR-193、let-7e和let-7i有结合位点。将包含有结合位点的3’UTR区分别构建到pmir-GLO和p EGFP-C2载体上,与miRNA共转至293T细胞,双荧光素酶的报告结果显示:pde6h分别和miR-124、miR-193、miR-199和let-7e具有靶向关系,pde6c分别与miR-124、let-7e和let-7i具有靶向关系;gnat2仅与miR-199具有靶向关系;pde6g和cngb3与预测有结合位点的miRNA均没有靶向关系。进一步针对绿色荧光蛋白表达量筛选的结果:将负向调控作用相对较弱的mRNA-miRNA对通过突变结合位点进一步进行验证,结果表明与绿色荧光筛选的结果一致,它们之间具有真正的靶向关系。此外,RT-qPCR结果显示,与其他组织相比,miRNA-124和miRNA-193在眼睛和脑组织中的显著高表达,miRNA-199在肾、胃和眼睛中显著性高表达;表明这3个miRNA在视觉发挥着重要的作用。本研究主要利用RT-qPCR方法分析了视觉转导相关的5个基因在牙鲆组织、变态期,TH、TU处理组和拯救组中的表达量;进一步通过双荧光素酶报告实验验证了T3通过TRαA和TRβ受体在转录前对PDE6s进行调控,此外还验证了gnat2对PDE6s的调控;miRNA也是牙鲆变态中重要的调控因子对靶基因进行转录后调控,最后利用双荧光素酶报告实验探究视觉相关的6个miRNA与视觉转导相关的5个基因之间的靶向关系,初步探究TH、视觉转导基因、miRNA三者在牙鲆视觉感光转导过程中的互作关系,深刻理解牙鲆变态期视觉感光转导系统发生适应性改变的机制。