【摘 要】
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背景结肠癌是世界第三大恶性肿瘤,危害人类健康。虽然手术结合辅助治疗提高了癌症患者的生存率,但超过50%的转移性患者术后5年内复发率很高,寻找有效的抑制治疗策略成为延长患者生存期的关键。丝裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）途径是癌症细胞生物学中最具特征的激酶级联之一,该信号通路在多种癌症的癌变和维持中发挥着重要的作用,但是MEK与结肠癌转移之间的关系还不是很明确。研究显示MTSS1抑制多种肿瘤的转移过程
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背景结肠癌是世界第三大恶性肿瘤,危害人类健康。虽然手术结合辅助治疗提高了癌症患者的生存率,但超过50%的转移性患者术后5年内复发率很高,寻找有效的抑制治疗策略成为延长患者生存期的关键。丝裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）途径是癌症细胞生物学中最具特征的激酶级联之一,该信号通路在多种癌症的癌变和维持中发挥着重要的作用,但是MEK与结肠癌转移之间的关系还不是很明确。研究显示MTSS1抑制多种肿瘤的转移过程。本论文旨在讨论MEK激酶与MTSS1与之间的调控关系。目的明确MEK2对结肠癌迁移和侵袭的影响,阐明MEK2通过靶向MTSS1蛋白调控结肠癌细胞迁移与侵袭的机制,为临床治疗转移性结肠癌寻找新的治疗靶点和策略。方法1.利用慢病毒质粒构建稳定低表达MEK1（sh MEK1）和MEK2（sh MEK2）的结肠癌HCT-116细胞系,使用Western Blotting（WB）实验检测稳定敲除细胞系中MEK1和MEK2的蛋白表达水平。2.细胞划痕实验和侵袭实验检测sh MEK1、sh MEK2和MEK1/2抑制剂binimetinib对结肠癌细胞侵袭和迁移的影响;WB实验检测sh MEK1、sh MEK2和MEK1/2抑制剂binimetinib对结肠癌细胞中转移抑制蛋白MTSS1表达的影响。3.GEPIA 2.0数据库分析MEK1、MEK2与MTSS1之间的相关性。4.利用MTSS1 si RNA,通过细胞划痕和侵袭实验明确下调MTSS1对sh MEK2和binimetinib处理结肠癌RKO和HCT-116细胞迁移和侵袭的情况。5.利用稳定转染sh NC和sh MEK2的HCT-116细胞构建人源异种移植裸鼠结肠癌原位模型,HE（伊红-苏木素）染色肝脏组织,观察结肠癌肝转移情况;利用HCT-116细胞构建裸鼠皮下瘤模型,瘤内注射binimetinib,观察肿瘤生长情况,WB检测经binimetinib处理的肿瘤组织内MTSS1蛋白的表达量,免疫组化检测肿瘤组织内MTSS1的表达情况。6.免疫共沉淀检测MEK与MTSS1之间的关系;质谱分析MEK2对MTSS1修饰方式和修饰位点。结果1.WB检测结果显示,与对照组相比较,sh MEK1、sh MEK2结肠癌细胞中MEK1、MEK2表达水平降低。2.与对照组相比较,抑制MEK1、MEK2表达可以明显的下调结肠癌细胞的迁移和侵袭能力;同时经过不同浓度的MEK1/2抑制剂binimetinib处理结肠癌细胞后,结肠癌细胞的迁移和侵袭受到明显抑制,对结果进行统计学分析,差异有统计学意义,P＜0.05。3.Western Blotting结果显示,给予不同浓度的binimetinib处理结肠癌RKO、HCT-116、Lo Vo、SW480后,结肠癌细胞内MTSS1蛋白表达水平增加。4.GEPIA 2.0数据库分析显示MEK2与MTSS1呈负相关,结果具有统计学意义,P＜0.05。5.Western Blotting结果显示,sh MEK2可引起MTSS1蛋白的表达量增加,而sh MEK1不能引起MTSS1蛋白的表达量的改变。6.sh MEK2细胞和binimetinib处理结肠癌HCT-116细胞中,MTSS1 si RNA可以明显的增强结肠癌细胞的迁移能力、侵袭的能力,对结果进行统计学分析,差异有统计学意义,P＜0.05。7.裸鼠结肠癌原位异种移植模型中,sh NC组裸鼠均发生了肝转移,sh MEK2组未发生肝转移,对结果进行统计学分析,差异有统计学意义,P＜0.05。8.裸鼠HCT-116细胞皮下移植瘤模型中,Western Blotting和免疫组化显示,与对照组相比,给予MEK1/2抑制剂binimetinib组MTSS1蛋白表达量上升。9.免疫共沉淀结果显示,MEK2蛋白可与MTSS1发生明显的结合。10.质谱分析结果提示MEK2可能磷酸化修饰MTSS1苏氨酸的595和603位点调控其细胞内表达。结论1.抑制MEK2可以明显的下调结肠癌细胞的迁移与侵袭的能力。2.抑制MEK2通过上调细胞内MTSS1的表达抑制结肠癌细胞侵袭和迁移3.MEK2通过磷酸化修饰MTSS1调控其表达。
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