磁性载体与纸基固定化α-葡萄糖苷酶的制备及应用研究

来源 :兰州大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:green7116xxx
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酶作为一种高效专一的生物催化剂已被广泛应用于催化、传感、精细化工和医药等领域。但游离酶的稳定性低,在实际操作中易受极端环境因素影响而发生变性失活,且游离酶难以被回收再利用,从而在一定程度上限制了其应用潜力。酶的固定化是提高游离酶操作稳定性和实现其重复使用的有效手段。而作为固定化酶重要组成部分的载体材料,其结构和性能对固定化酶的活性和后续应用至关重要,因此,发展新型高效的酶固定化载体材料以及固定化方法是酶研究领域的重要内容。基于此,本论文以2型糖尿病的重要治疗靶标α-葡萄糖苷酶为研究对象,制备了三种载体材料,并根据其各自的特点采用不同的固定化方法将α-葡萄糖苷酶固定于相应的载体材料,进一步结合毛细管电泳分析技术对制备的固定化酶开展酶促反应动力学、抑制动力学研究以及性能评价,最终将其应用于中药酶抑制剂的筛选。主要研究内容如下:(1)磁性金属有机骨架固定化α-葡萄糖苷酶的制备及抑制剂筛选。采用溶剂热法制备了羧基化Fe3O4磁性纳米粒子,以磁性纳米粒子为载体,壳聚糖为修饰剂,通过壳聚糖(CS)与磁性纳米粒子的静电相互作用和三聚磷酸钠的交联作用,使壳聚糖沉积在Fe3O4表面,形成Fe3O4@CS核壳结构,随后加入Zn2+溶液,CS与Zn2+螯合,形成Fe3O4@CS@Zn2+复合物,最后,加入α-葡萄糖苷酶和2-甲基咪唑溶液,Zn2+和有机配体二甲基咪唑通过配位作用在磁性纳米粒子表面自组装形成三维多孔框架结构ZIF-8,同时α-葡萄糖苷酶通过仿生矿化作用将被原位封装ZIF-8结构中,最终形成Fe3O4@CS@ZIF-8@α-葡萄糖苷酶复合物,实现了α-葡萄糖苷酶在载体材料组装过程中的原位固定。利用透射电镜(TEM)、红外光谱(IR)、X-射线衍射(XRD)和振动样品磁强计(VSM)对制备的酶固定化载体材料的形貌、化学组成、结构和磁化特征进行了表征。结合毛细管电泳分析技术,对固定化酶的酶促反应动力学、抑制动力学和性能进行了研究。研究表明经固定后的α-葡萄糖苷酶展现出比自由酶更高的p H和热稳定性,连续催化10次后其活性仍能保留初始活性的73.56%。进一步结合毛细管电泳分析技术将其成功应用于14种中药甲醇提取液中α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选,结果发现大黄的抑制效果最好,在浓度为10 mg/m L时,其抑制率达到100%,将其浓度降低为5 mg/m L时,其抑制率依然高达(95.23±0.35)%。(2)磁性共价有机框架固定化α-葡萄糖苷酶的制备及抑制剂筛选。以Fe3O4磁性纳米粒子为载体,有机单体1,3,5-三(4-氨苯基)苯和2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛在醋酸的催化下共价连接在一起,形成具有周期性结构的多孔骨架覆盖在载体表面,形成核壳型Fe3O4@COF。通过TEM、XRD、FT-IR和VSM对其进行了表征。进一步,以戊二醛为交联剂,将α-葡萄糖苷酶通过共价偶联作用固定于Fe3O4@COF。结果显示固定化α-葡萄糖苷酶显示出优异的p H和热稳定性、重复使用性能和储存稳定性。结合毛细管电泳分析技术,将制备的固定化酶成功应用于18种中药酶抑制剂的筛选。(3)纤维素滤纸固定化α-葡萄糖苷酶的制备及抑制剂筛选。受贻贝黏附性能的启发,采用低成本的邻苯二酚和四乙烯五胺对纤维素滤纸表面进行氨基化改性,在其表面形成类似聚多巴胺的均匀涂层,通过聚乙二醇二缩水甘油醚两端的环氧基将α-葡萄糖苷酶共价偶联在氨基化改性的纤维素滤纸上。纤维素滤纸固定化α-葡萄糖苷酶具有与反应介质可即时分离的特点,极大方便了后续酶促反应动力学、抑制动力学研究、性能评价以及酶抑制剂筛选。结果显示α-葡萄糖苷酶经固定后其p H、热稳定性均得到明显提升,且重复使用10次后其酶活性仍保留初始酶活性的68.36%。11种中药甲醇提取液中,诃子、毛诃子与余甘子表现出了良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
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