【摘 要】
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在规模化的养殖中,抗菌药物的大量使用导致细菌耐药率逐渐上升,表明开发新的抗菌药物或抗生素佐剂已经成为亟待解决的问题。本研究以广西区猪、鸡和牛蛙养殖场的多黏菌素耐药菌株为调查对象,检测mcr基因阳性的细菌,进一步寻找能与多黏菌素协同的天然活性物质。本研究分为四个部分进行研究,具体方法和结果如下:第一部分:本章内容对mcr阳性菌株的筛选及携带mcr-9弗氏柠檬酸杆菌的鉴定。通过细菌分离获取398株多黏
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在规模化的养殖中,抗菌药物的大量使用导致细菌耐药率逐渐上升,表明开发新的抗菌药物或抗生素佐剂已经成为亟待解决的问题。本研究以广西区猪、鸡和牛蛙养殖场的多黏菌素耐药菌株为调查对象,检测mcr基因阳性的细菌,进一步寻找能与多黏菌素协同的天然活性物质。本研究分为四个部分进行研究,具体方法和结果如下:第一部分:本章内容对mcr阳性菌株的筛选及携带mcr-9弗氏柠檬酸杆菌的鉴定。通过细菌分离获取398株多黏菌素耐药菌株,进一步通过mcr基因检测和16S r DNA鉴定得到5株mcr阳性分离株（5/398,1.2%）,包括3株鸡源mcr-1阳性大肠杆菌（EC12、EC67和EC72）、1株猪源mcr-1阳性大肠杆菌EC43和1株牛蛙源mcr-9阳性弗氏柠檬酸杆菌Cf1。本章后续以Cf1为研究对象,通过毒力基因检测、致病性试验等方法进行研究,显示菌株携带具有生物特性的毒力因子cfa、ure D、ure E、ure F和omp X,并且其生长对数期细菌可使小鼠在12 h内出现死亡。综上所述,该弗氏柠檬酸杆菌为致病性菌株。采用多位点序列分型（MLST）的方法,结果显示弗氏柠檬酸杆菌属于ST401型（等位基因谱为:156-94-81-73-90-1-162）。第二部分:对mcr基因的可转移性和mcr-9弗氏柠檬酸杆菌的分子特征进行分析。采用CLSI推荐的微量肉汤稀释法测定EC43和Cf1对14种抗生素的MIC,显示二者至少对3种抗生素耐药,证明两菌株都为多重耐药菌株。全基因组测序（WGS）、可转移性研究及药物敏感性试验结果显示本试验的mcr-9位于一个大型拼接的质粒上,由两侧插入序列（IS）包围,其在一定条件下可以转移但单独存在时不表达多黏菌素抗性（MIC＜1μg/m L）,而EC43携带的mcr-1基因可水平转移并表达多黏菌素抗性表型（MIC=2μg/m L）。WGS和生物信息学分析显示菌株Cf1携带1个染色体和6个质粒。使用Res Finder 4.1分析菌株携带多种耐药基因,包括qnr B29、aac（3）-IId、aad A2、dfr A12、sul1、sul2、blaCMY-46、mph（A）、qac E、tet（D）、blaTEM-1B、qep A1、qnr S1、aph（3’-Ia）、mcr-9和flo R;使用Plasmid Finder2.1分析菌株携带三种质粒复制子Inc FIB、Inc HI2/Inc HI2A和Inc X7;使用VFDB数据库分析菌株携带多种菌毛相关蛋白pil W、粘附相关因子adh D、铁载体相关蛋白irg A等;Clustalw分析显示mcr-9基因与数据库里其他mcr-9基因变体相比有一个氨基酸的差异。第三部分:与多黏菌素具有协同活性的牛至精油的筛选。本章以Cf1为主要试验对象,筛选与多黏菌素具有协同抑菌活性的天然活性物质。药物敏感性试验用于确定具有抑菌效果的中药及多重耐药菌株,分子生物学鉴定用于确定菌株物种,结果显示钻地风、牛至精油（OEO）、肉桂精油和丁香精油的MIC分别为125 mg/m L、0.72 mg/m L、0.58 mg/m L、2.08mg/m L;选择的革兰氏阴性短稳杆菌（EB28、EB1和EB42）、大肠杆菌（EC12、EC43、EC67和EC72）以及革兰氏阳性泰式肠球菌（M90）都是多重耐药菌株。诱导试验用于获取多黏菌素耐药的鲍曼不动杆菌ATCC19606（MIC,32μg/m L）和大肠杆菌ATCC 25922（MIC,8μg/m L）。棋盘试验显示OEO与多黏菌素联合用药对弗氏柠檬酸杆菌、革兰氏阴性短稳杆菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌及革兰氏阳性泰式肠球菌均有协同抑制活性,FICI的范围为0.0937～0.375。第四部分:对牛至精油与多黏菌素的体外协同作用进行研究。通过生长曲线测定、细胞内容物泄露试验、分子检测和凝胶阻滞试验、荧光染色试验（NPN、PI）、ROS和ATP测定试验,研究OEO增强多黏菌素对Cf1的体外抗菌效果。结果显示多黏菌素（1/8 MIC）和OEO（1/4 MIC）联合用药与多黏菌素组（1/8 MIC）或OEO组（1/4 MIC）或空白组相比,能够完全抑制Cf1的生长（P＜0.05）,使细胞内大分子物质泄露（P＜0.05）但不影响遗传物质DNA分子的完整性,同时导致细菌细胞膜被破坏（P＜0.01）,增强细菌内ROS水平（P＜0.001）,抑制细菌ATP的生成（P＜0.05）并影响正常能量代谢。结论:本研究中mcr阳性菌株的检出表明菌株在适应环境变化产生的压力。并且本研究揭示OEO不仅单独抑菌活性强,而且与多黏菌素联合用药抑菌效果显著,证明OEO具有作为多黏菌素增强剂的潜力,为后续开发OEO作为多黏菌素增效剂的产品进行应用提供数据支撑。
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