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Reteplase(rPA)是组织型纤溶酶原激活剂(tissue-typeplasminogenactivator，t-PA)的一种缺失突变体，由于在半衰期和疗效上比t-PA有一定的优越性，已成为最重要的新型溶栓药物之一。本研究通过应用构建的Pichia.pastoris(GSll5pPIC9-rPA)为对象，研究了发酵条件对酵母生长及其表达rPA的影响，并通过对发酵过程中表达rPA阶段的相关参数、代谢流分布以及关键酶活等方面分析探讨了发酵调控机理。
细胞活性(cellviability)是重组毕赤酵高表达rPA重要发酵生理参数之一。通过应用碘化丙锭(propidiumiodide，PI)染色法，建立了流式细胞仪检测细胞活性的方法，并在P.pastoris高密度发酵过程中得到应用。试验结果表明：到发酵后期，随着细胞密度的增加，细胞死亡率急剧从5﹪上升放罐时的14﹪；与此同时，目的蛋白rPA浓度则下降了17﹪。此外，实验结果还发现细胞活性与细胞形态密切相关。细胞活性高，细胞形状呈圆形或椭圆型，细胞着色较深；细胞活性低，则细胞个体变小，形状为近乎杆型或棒状，细胞着色不均匀，染色较浅。
防止rPA降解是实现重组P.pastoris高密度培养高表达rPA主要策略之一。通过试验表明：(1)pH是引起rPA降解的最关键影响因素。在低的pH条件下由于降解严重，几乎没有rPA的表达量，在pH6.5条件诱导下，蛋白酶活性最低，rPA产量最大，摇瓶诱导培养rPA产量达到17.9mg/L，在5L罐高密度培养rPA产量达到122mg/L。通过蛋白酶抑制剂试验，表明这些蛋白酶主要属于丝氨酸类蛋白酶，因此pH对rPA产量的影响是通过影响蛋白酶活性作用的。采用细胞生长阶段调整pH到6.5的策略，进一步降低了蛋白酶的活性，rPA的表达量提高到153mg/L。(2)温度是影响rPA产率和稳定性的另一个重要因素。通过将诱导温度从30℃降低到20℃，细胞死亡率可减小1倍以上，胞内AOX酶活性提高2倍，总蛋白酶的活性降低了12﹪，摇瓶培养rPA的表达量从18.2mg/L提高到25.2mg/L，5L罐高密度培养rPA的表达量从153.2mg/L提高到207.9mg/L。(3)在培养基中补加酪蛋白水解物、蛋白胨等蛋白酶竞争性底物组分，使rPA的表达量提高了12﹪。。
对rPA发酵过程中不同阶段的补料策略优化结果表明：(1)在甘油生长阶段，通过将甘油相细胞比生长速率从0.09h-1提高到0.19h-1，甘油的比消耗速率和甘油得率分别从0.052gglycerolgDCW-1·h-1和0.42gDCWgglycerol-1增加为0.089gglycerolgDCW-1·h-1和0.49gDCWgglycerol-1，同时提高了诱导相细胞生长，甲醇消耗和目的蛋白rPA的生成速率，rPA的表达量从140.2mg/L增加到199.5mg/L。(2)在甲醇诱导阶段，在3g/L甲醇浓度条件下，细胞生长最适，至诱导第84h时细胞干重最大，为207g/L；而在恒定5g/L甲醇浓度却最有利于rPA的表达，至诱导第84h时，rPA含量最大达229.6mg/L，此时甲醇的比消耗速率也最大，为0.124gmethanol·gDCW-1·h-1。因此，rPA的生成速率与甲醇的消耗速率密切相关，为此，应用在线甲醇电极采用动态的甲醇浓度控制策略，即通过逐步提高甲醇浓度来提高甲醇比消耗速率，rPA的表达量提高到269.7mg/L。
采用15L全自动多参数发酵罐进行rPA的放大发酵培养，至诱导85h放罐时rPA产量达到319.4mg/L。通过对表达rPA阶段的相关参数、代谢流分布以及关键酶活等分析说明，在细胞进入目的蛋白表达阶段的初始阶段，利用甲醇代谢途径的相关酶的表达被启动，以甲醇完全氧化途径(甲醛途径)为主，同时由于碳源的改变，胞内代谢流进行了重新分配，使得糖酵解途径减小，磷酸戊糖途径通量增加；细胞适应甲醇为底物代谢后，各途径中关键酶酶活均不断增大，细胞代谢旺盛，OUR和CER急剧上升，但是甲醛途径通量急剧减少，消耗的甲醇主要通过二羟丙酮循环和5-磷酸木酮糖进入磷酸戊糖途径，菌体合成更多氨基酸合成所必须的NADPH，为蛋白质的合成提供足够的还原力和合成表达rPA所必须的氨基酸等物质，同时消耗大量的能量。此时甲醇消耗速率和目的蛋白rPA表达速率都为最高，结果还说明必须协同磷酸戊糖途径和糖酵解途径才能最大程度表达rPA；至发酵后期，尽管菌体代谢主要以磷酸戊糖途径为主，但各代谢酶的活性下降，甲醛途径和糖酵解途径通量进一步减小，甲醇消耗减少，而维持菌体生命活性所需的甲醇量占总消耗量中的升高，导致细胞生长和rPA表达速率下降。