论文部分内容阅读
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)具有分化潜能、自我更新能力和低免疫原性,是再生医学领域最有潜力的种子细胞。尽管当前MSCs的临床应用已成为现实,但直接供体来源MSCs数量有限,而临床治疗所需细胞剂量大,传统的体外2D含血清培养又会影响细胞产品的质量、数量和安全,并不能完全满足临床需求。因此,鉴于临床级MSCs扩增要求,本研究采用全细胞贴附法分离得到大鼠骨髓来源MSCs(Bone marrow-derived MSCs,bMSCs)和脂肪来源的 MSCs(Adipose-derived MSCs,aMSCs),利用形态学观察、增殖检测、集落形成能力评价、诱导分化实验以及表面表型分析等手段,对比考察长期培养和微载体扩增对不同组织来源MSCs生长和功能特性的影响,并研究了不同生物活性分子组合对MSCs贴附生长的影响,以筛选适合MSCs生长的无血清培养基。首先,通过考察长期培养对bMSCs和aMSCs的影响,发现bMSCs和aMSCs细胞形态上无明显差异,但是在220天的长期培养过程中两种细胞形态均呈现变小的趋势,同时集落形成能力下降,而增殖能力增强。经综合比较可以看到,bMSCs的增殖能力强于aMSCs,并且只有bMSCs能长期保持分化能力。此外,CD29+/CD90+/CD34-/CD45-的表达情况不依赖于MSCs的类型和倍增数,而CD44、CD73和CD106则表现出相反的现象。其次,通过系统对比微载体上MSCs的扩增行为,本研究发现MSCs体外扩增效果依赖于微载体种类和MSCs的来源。一方面,bMSCs在Cytopore 2以及aMSCs在Cytodex 1和Cytodex 3上能够在保持其自我更新和分化能力的基础上进行贴附生长,在培养14天内的实际最大扩增倍数分别为4.56、3.53和1.79;另一方面,虽然bMSCs在Cultispher S以及aMSCs在Cultispher S和Cytopore 2上,可分别实现4.84、4.23和3.36倍的扩增,但bMSCs和aMSCs均不能维持其集落形成能力和分化能力。最后,通过研究不同生物活性分子组合对bMSCs贴附生长的维持效果,发现胰岛素、非必需氨基酸溶液、L-VC、EGF、PDGF-BB以及Collagen I能显著促进bMSCs的增殖。基于此,本研究初步筛选出能够维持bMSCs贴附增殖、表面抗原表达和成骨及成脂分化的无血清培养基opt-2。综上,本研究考察了长期培养对不同来源MSCs影响,初步确立了适于MSCs体外扩增的微载体和无血清培养基。当然,无论是微载体培养体系还是opt-2培养基,都有待进一步优化以更大程度地提高MSCs扩增效率。本论文工作为将来建立临床级MSCs的大规模扩增体系提供了科学指导,这将能极大促进MSCs的广泛临床应用。