类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种最常见的自身免疫性疾病，慢性的关节滑膜炎是该疾病的特征性表现，而关节软骨和骨的渐进性破坏，导致了关节功能的障碍，甚至患者生活质量的极大影响。RA的病因不明，但最近的研究显示：滑膜组织局部中活化的成纤维样滑膜细胞，作为复杂细胞调控网络中的一员，在RA的发生发展中发挥着重要作用，因而引起了研究人员的极大关注。由于类风湿性关节炎在中晚期病变的复杂性，单一信号转导通路的研究恐难详述其发病机制，因此急需对RA滑膜细胞内复杂的信号转导网络关系进行深入探讨。本课题的研究目的就是利用功能基因组学与蛋白质组学的方法探寻RA与正常滑膜表达差异的基因，从而为进一步揭示和阐明RA的病理机制做出贡献。基因表达谱芯片作为生物技术中的新兴工具，可以从全局角度同时对上万种基因的表达水平进行检测成为可能，我们首先利用表达谱芯片从RNA水平探讨RA滑膜细胞相对于正常与骨性关节炎滑膜细胞差异表达的基因。我们体外分离了RA、骨性关节炎与正常滑膜组织，经原代培养生长至第四代的成纤维样滑膜胞用于实验。分别提取类风湿性关节炎滑膜细胞、骨性关节炎滑膜细胞和正常滑膜细胞的总RNA，反转录成cDNA,并以两种荧光Cy5和Cy3分别进行标记,再与覆盖21073条人类基因的Agilent Human1A表达谱芯片进行杂交，扫描芯片荧光信号，用基因图像分析软件对扫描图像进行数字化处理和分析。结果显示，共筛选出RA滑膜细胞与正常滑膜细胞表达显著差异的基因共1816条，其中1250种基因表达水平上调，566种基因表达下调；在上调的基因中，有17种基因上调程度达到在正常中的100倍以上，且上调的基因中有许多都与RA的类肿瘤性质相关，如细胞增殖、粘附、细胞周期调控及侵袭。这些结果提示我们RA的发病是多因素多基因共同作用的结果。RA滑膜与正常滑膜差异表达的1816种基因可能参与了RA的发生和发展,对这些基因进一步进行研究有助于阐明RA的发病机制和找到新的疾病相关关键分子。于是我们随后对芯片结果进行了生物信息学分析，意图从这些基因表达谱信息中挖掘反映疾病本质特征的相关基因。分析结果提示我们，与RA滑膜细胞类肿瘤性质相关的基因大部分落在RA较OA和正常均上调组。在这些基因中，涉及肿瘤相关通路、细胞周期调控、细胞受体与细胞外基质相互作用等功能的基因。我们通过综合芯片的生物信息学分析的结果，选择了14个基因利用real-time PCR对它们的表达水平进行了检测，除了CDKN1A，其余13种基因均与芯片结果一致。表明了我们的实验具有良好的重复性及我们获得的结果有较好的可信度。综合芯片结果及生物信息学分析，我们认为RA与正常及OA滑膜细胞有着明显的表达谱差异，而部分差异的分子导致了RA滑膜细胞生物学功能的差异及参与了RA这种疾病的发生和演进。而接下来进一步对其中的关键分子进行深入研究，将有助于我们更好地理解RA的病理过程并可能将其作为潜在的药物靶位指导临床治疗。目前的研究表明，RA关节软骨破坏主要是由过度增殖的滑膜细胞和滑膜组织分泌的基质金属蛋白酶造成的：基质金属蛋白酶降解软骨基质的主要成分II型胶原，而断裂的II型胶原又可作用于滑膜细胞诱导其分泌基质金属蛋白酶，所以阐明II型胶原介导基质金属蛋白酶分泌的关键途径和分子是未来治疗RA和减轻关节软骨破坏的重要突破口。根据芯片的结果及本课题组之前的工作，我们提出了DDR2-CYR61-MMPs通路在RA关节软骨破坏中可能扮演着重要角色，结果证实活化的DDR2的确可上调CYR61表达，进而上调MMP-13的表达及促进RA FLS的侵袭。并在DDR2突变小鼠模型中证实DDR2缺失能够抑制CYR61的表达及抵抗胶原诱导的关节损伤。在大鼠模型中证实下调CYR61后能有效改善CIA大鼠关节损伤。其后还证实了CYR61能够促进RA滑膜细胞的增殖，为阐明RA的发病机理提供了重要线索。MicroRNA与RA病理进程相关的研究刚刚起步，已有研究表明一些microRNA在RA滑膜组织中表达异常。我们利用生物信息学，通过对DDR2、MMP-1、MMP-13、STAT3基因3’-UTR及编码区的分析，预测了可能对这些基因产生调控作用的miRNA。接着，在对这些miRNA的实时定量PCR检测中发现:在II型胶原刺激后，miR-16-1、miR-143、miR-29a在II型胶原刺激后的RA成纤维样滑膜细胞中表达下调。提示这些miRNA表达的改变可能共同参与了RA的病理过程，促进了II型胶原介导的RA病程的进展,我们也将进一步探索这些信号调节网络参与RA病理进程的具体作用机制。我们知道，蛋白质磷酸化是最常见、最重要的蛋白翻译后修饰方式之一。在真核细胞中，蛋白质的磷酸化主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸三个残基上，尽管酪氨酸磷酸化的丰度非常低，但是它在很多重要的生理和病理过程如增殖、分化、凋亡、迁移等中均扮演了重要角色；酪氨酸磷酸化信号转导网络的紊乱通常与许多疾病密切相关，例如癌症。因此酪氨酸磷酸化蛋白质组学不仅在数量上能比较系统的分析某一过程或现象，而且在质量上也提供了基因组所不能给出的信息。本文首次应用差异蛋白质组学技术分析了RA成纤维样滑膜细胞内酪氨酸磷酸化蛋白质在胶原刺激前后的表达差异，发现了一个可能与RA发生发展相关的蛋白ANXA5，对其进一步研究发现ANXA5确实参与了II型胶原刺激后RA成纤维样滑膜细胞内酪氨酸磷酸化信号转导通路的活化，但具体机制还需进一步研究。