肉毒梭菌在繁殖过程中所释放的肉毒毒素是目前已知天然和合成毒素中毒性最强的生物毒素,可经过罐头食品、真空包装食品、密封腌渍食品等引起细菌性食物中毒。传统检测方法是通过实验室菌群培养,再采用生物学方法进行检测,其操作复杂,检测周期一般在10天以上,不利于风险的及时控制。因此,寻找一种快速、无损、简便的肉毒梭菌检测方法具有重要意义。显微共聚焦拉曼光谱是一种快速、可靠、无损且无需样品预处理的方法,克服了常规拉曼光谱拉曼信号弱的问题,在高分辨率下检测μm级的单个细菌。本文旨在建立一种结合化学计量学的显微共聚焦拉曼光谱技术,对肉毒梭菌菌属、菌种和血清型三个层次上的快速鉴别。实验选取532 nm激光作为激发光,物镜选择50倍,输出功率为40 m W,光谱分辨率为0.6 cm-1,光栅为1200 mm,光谱采集范围设置为600～1800 cm-1,扫描次数为6次,积分时间为10 s。在菌属层次上,实验选择不同菌属的6种食源性致病菌（肉毒梭菌、福氏志贺氏菌、单增李斯特菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌）,采集拉曼光谱数据,基于4种光谱预处理方法,结合谱图解析、无监督技术和有监督技术对光谱数据进行分析。利用主成分分析（PCA）研究不同种类细菌的差异以及对数据降维,比较了3种有监督分类模型的性能,包括决策树（DT）、人工神经网络（ANN）和Fisher判别分析（FDA）,并探讨了4种光谱预处理方法对模型的影响。结果表明,通过比对特征峰和峰高比数值可以区分不同致病菌,但自动化能力较差,容易出现人工误差,不能满足大样本的检测需要。在无监督PCA模型中,可以实现样本的初步分类。在有监督分析中,DT模型中的分类与回归树（CART）算法结合预处理方法卷积平滑一阶导数（SG 1st Der）得到了最佳的DT模型,训练集的正确率（CRR）为100.00%,验证集的CRR为98.1%（157/160）;ANN模型中的多层感知器（MLP）算法结合预处理方法多元散射校正（MSC）得到了最佳的ANN模型,训练集的CRR为100.0%,验证集的CRR为99.4%（159/160）;FDA模型结合SG 1st Der预处理方法得到了最佳FDA模型,训练集和验证集的正确率均为100.0%,在3种模型中表现最佳。在菌种层次上,实验选择同属于梭菌菌属的3种食源性致病菌（肉毒梭菌,产气荚膜梭菌和艰难梭菌）;在血清型层次上,实验选择2种和人体患病相关的肉毒梭菌,分别是A型和B型。基于4种不同的光谱预处理方法,采用PCA和主成分分析-线性判别分析（PCA-LDA）对不同菌种和血清型的样本进行研究。结果表明,不同预处理方法下的模型精度存在差异。在同一菌属不同菌种的3类样本中,基于SG 1st Der,样本在PCA模型中可以被完全区分。在不同血清型的2类样本中,基于SNV,样本在PCA模型中基本可以被区分,但不能避免样本重叠的问题,而在PCA-LDA模型中,在不使用任何预处理方法时,样本得到明显的区分,经交叉验证后的CRR为100%。综上所述,本文建立的显微共聚焦拉曼光谱法结合化学计量学可以实现肉毒梭菌在菌属、菌种和血清型三个层次上的区分鉴别,与传统检测方法相比,具有操作方便和快速的优点,可以为食品安全犯罪案件的侦破提供方向,为食品安全监管等领域的研究提供参考。