法匹拉韦是一种广谱抗病毒药物,主要用于治疗流感病毒。目前合成法匹拉韦的研究中多采用化学合成法,并且生产工艺复杂。3,6-二氟吡嗪-2-甲酰胺是合成法匹拉韦的关键中间体。生物催化在药物生产中反应条件温和,其高选择性,可以大幅减少合成步骤和副产物的生成,并且在有效减少危险废弃物和化学原料的使用方面也具有独特优势,是重要的绿色化学合成技术。现在虽然各种数据库中腈水合酶的基因资源较为丰富,但是能够催化氰基吡嗪制备酰胺吡嗪的腈水合酶相关研究较少,利用酶催化3,6-二氟吡嗪-2-甲腈合成法匹拉韦中间体3,6-二氟吡嗪-2-甲酰胺是一种新颖的绿色合成方法。本文首先通过文献调研确定了所要克隆表达的腈水合酶基因来源,进一步通过序列分析、密码子优化确定所要合成腈水合酶基因序列及连接质粒进行全基因合成。之后将全基因合成产品经重组质粒的提取和转化等步骤构建得到两株基因工程菌株为E.coli BL21（DE3）/pET24a（+）-CtNHase和E.coli BL21（DE3）/pET24a（+）-Rr NHase。两株菌株诱导表达后均可产生腈水合酶蛋白的可溶性表达,并且均可完成目的反应的生物转化。其次,为了找到更适合进行3,6-二氟吡嗪-2-甲酰胺工业生产应用的重组菌株,我们对所构建的两种基因工程菌进行催化性能的评估。主要考察了两株基因工程菌DMF耐受性,不同体系下的催化目标底物能力,不同体系下的热稳定性,以及两种菌株的细胞酶活和酶液酶活,最终确定E.coli BL21（DE3）-pET24a（+）-CtNHase更具有工业应用潜力。将其作为进一步的研究对象,研究了此菌株在不同底物浓度下的催化能力,当底物浓度3M,添加1gdcw/L细胞,反应6h即可基本完成目标底物的全部转化。最后,为了进一步提高重组腈水合酶的高效表达,我们对优选菌株E.coli BL21（DE3）-pET24a（+）-CtNHase进行摇瓶水平的发酵优化。主要研究了碳源种类及浓度,发酵液初始pH,诱导剂浓度,诱导剂加入时细胞OD600值,诱导温度及时间,发酵液装液量对于重组菌细胞生长和产酶的影响。优化后发酵培养基组分为:胰蛋白胨16 g/L,酵母粉10g/L,NaCl 5 g/L,乳糖10 g/L,pH 7.5。优化后培养过程为:细胞在50m L发酵培养基中生长至OD600值为1.5时,加入0.6m M的诱导剂IPTG,在温度28 ℃时,200rpm,诱导12h。经过发酵优化后细胞的生物量较优化前提高了21%,比酶活提高了68%,发酵液酶活提高至2倍。