【目的】前期研究结果提示我们,Slit2过表达会导致小鼠出现记忆力损伤,并出现类似AD模型鼠Tg2576的脑部神经元空泡样变性,神经元丢失及代谢物的异常等。因此,本实验将过表达Slit2蛋白的转基因小鼠与转入了人源性的APP695基因的AD模型鼠Tg2576进行杂交,建立了Slit2蛋白过表达的AD模型鼠,并对该小鼠进行行为学、组织病理学、分子生物学等方面的研究,以探讨Slit2蛋白过表达对阿尔兹海默症发病的影响。【方法】1.Slit2过表达AD模型鼠的构建和行为学研究。使用6-8周龄的转基因小鼠进行繁殖,选取雄性Tg2576小鼠与雌性Slit2-Tg小鼠进行杂交,对子代进行PCR基因鉴定后筛选出Slit2-Tg小鼠、Tg2576小鼠、Tg2576;Slit2小鼠及野生型(WT)小鼠。对3、6、9月龄的小鼠进行行为学检测,包括避暗实验、Morris水迷宫实验、旷场迷宫实验及高架十字迷宫实验。2.Slit2过表达AD模型鼠的病理特征研究。采用HE染色观察小鼠脑内病理形态学改变;免疫组化和Western Blot测定小鼠的脑内beta amyloid蛋白的表达情况;ELISA对各组小鼠脑组织及血清中Aβ1-40及Aβ1-42的含量进行检测。同时对脑内乙酰胆碱酯酶的表达情况及小胶质细胞的激活情况进行观察。3.Slit2过表达影响AD的机制研究。采用HE染色,Evans Blue实验,活体成像实验对Slit2-Tg小鼠脑血管功能的检测,进一步采用免疫组化对脑血管上Aβ转运体RAGE和P-g P进行观察。【结果】1.PCR鉴定基因型结果:Tg2576;Slit2小鼠在428b和1000bp处均有清晰条带,Slit2-Tg小鼠仅在1000bp处有清晰条带,Tg2576小鼠仅在428bp处有清晰条带,WT小鼠无目的基因,故无条带显示。2.行为学结果显示:避暗实验结果说明Tg2576;Slit2-Tg小鼠与Tg2576小鼠相比,错误次数更多,潜伏期更短。Morris水迷宫实验中,定位航行实验说明,Tg2576;Slit2小鼠表现出逃避潜伏期较长的趋势;空间探索实验说明,与Tg2576小鼠相比,Tg2576;Slit2小鼠在平台象限路程百分比,时间百分比均减少,有显著性差异。进一步利用行为学对其焦虑指标进行检测,由旷场迷宫实验结果可以看出,9月龄时,与Tg2576小鼠相比,Tg2576;Slit2小鼠在中央区域路程百分比明显减少,有显著性差异。由高架十字迷宫实验结果可以看出,9月龄时,与Tg2576小鼠相比,Tg2576;Slit2小鼠在进入开臂区域路程百分比、进入开臂次数百分比减少明显,有显著性差异。3.HE染色结果可以看出:WT小鼠脑部神经元细胞完整,细胞数目较多,排列整齐;而与WT小鼠相比,其余各组小鼠均出现神经元空泡样变性,细胞排列疏松,其中Tg2576;Slit2小鼠较为严重。4.免疫组化与Western Blot检测小鼠脑内beta amyloid蛋白结果显示:Tg2576;Slit2小鼠脑内beta amyloid蛋白的阳性表达明显增多,形成黄褐色淀粉样斑块。同时,Western blot结果半定量说明Tg2675;Slit2小鼠脑内beta amyloid蛋白的表达水平比Tg2675小鼠有显著性的增高。进一步对12月龄四组小鼠脑组织及血清中Aβ1-40和Aβ1-42的含量检测结果显示:Slit2过表达后,Tg2576;Slit2小鼠脑组织Aβ1-40,Aβ1-42的含量显著性高于Tg2576小鼠,而在血清中Aβ1-40,Aβ1-42的含量并没有明显差异,最终导致Aβ1-40在脑组织与血清中的比率明显增加,但Aβ1-42在脑组织与血清中的比率并未明显增加。5.免疫组化检测12月龄各组小鼠皮层和海马中乙酰胆碱酯酶的表达发现:Slit2过表达后,表现为Tg2576;Slit2小鼠脑组织中ACh E的含量显著性高于Tg2576小鼠。6.免疫荧光与免疫组化实验相结合检测12月龄各组小鼠脑部小胶质细胞的激活情况发现:在皮层区域,小胶质细胞激活比较明显。与WT小鼠相比,Tg2576小鼠,Tg2576;Slit2小鼠皮层均出现小胶质细胞胞体肿胀,小胶质细胞出现明显的激活。7.HE染色结果显示Slit2-Tg小鼠脉络丛结构出现破坏,Evans Blue及活体成像实验说明Slit2-Tg小鼠会出现血脑屏障渗透增加。进一步检测12月龄各组小鼠脑部Aβ转运体RAGE和P-g P的表达情况发现:Tg2576;Slit2小鼠脑血管上RAGE的表达有所增强,p-gp的表达明显减少。【结论】1.本实验成功构建了Slit2蛋白过表达的AD模型鼠(Tg2576;Slit2)。2.Tg2576;Slit2小鼠比Tg2576小鼠有更明显的学习和记忆的障碍,并且有焦虑的表现。3.Tg2576;Slit2小鼠脑部更易出现Aβ蛋白的沉积,同时乙酰胆碱酯酶表达增多,炎症细胞激活。4.其机制可能与Slit2过表达导致血脑屏障破坏,从而使血脑屏障上的Aβ转运体的表达出现异常有关。5.Tg2576;Slit2小鼠可作为研究脑血管损伤对阿尔兹海默病作用的动物模型。