背景急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是呼吸危重症的棘手问题,常由肺部或全身严重的感染引起,主要临床表现为顽固性低氧血症。近年来,在治疗ARDS的手段和方式均取得了显著进展,治愈率和死亡率均得到改善。但目前对于哪些人群在感染时易发生ARDS缺乏预警指标,且现阶段针对ARDS依然没有特异靶向的药物治疗,救治方式多以对症支持治疗为主,因此深入探讨ARDS的发病机制及可能的预警指标具有重要的临床意义。ARDS的主要病理改变是感染后全身过度的炎症反应引起的炎症风暴直接损伤肺上皮细胞及血管内皮细胞,肺泡腔及间质中大量炎性细胞浸润,以及外周循环的免疫细胞的过度激活和募集。除了AP-1（Activating protein-1）、NF-κB、STAT1（signal transducer and activator of transcription 1）等大量促炎信号通路过度激活,炎症负性调控的通路显著失衡也是加重组织损伤的重要因素之一。其中过氧化物酶体增殖物激活受体PPARγ（peroxisome proliferators-activated receptorγ）就是炎症负性调控中重要的一个分子,对免疫细胞的发育成熟、活化调控、炎症介质的释放均有显著的调控作用,成为近年来的研究热点。本课题组前期发现,在脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的小鼠ARDS模型肺组织及外周血中PPRAγ表达降低,提示PPARγ的下调可能与ARDS的发生密切相关,但其下调的分子机制及对ARDS的调控方式还有待明确。micro RNAs（miRNAs）是长度约为20个核苷酸的非编码小RNA,可以与靶mRNA的互补配对而降解靶mRNA或抑制其翻译,是生物体内抑制/降低蛋白表达的重要机制之一。我们通过高浓度LPS刺激人肺上皮细胞系来模拟ARDS,分析和筛选ARDS条件下可能参与调控PPARγ表达的miRNAs,进一步研究结果提示自噬相关通路的改变可能与PPARγ的低表达/抑制密切相关。因此,本研究围绕PPARγ在ARDS过程中的下调机制,及其下调后的炎症调控是否与自噬相关进行探索,为深入了解ARDS肺部的病理改变提供可能的分子机制。除了研究ARDS的发病机制外,如何便捷、快速、准确的预判ARDS的发生也是目前亟需解决的问题。例如脓毒症是ARDS的常见原因,但很大一部脓毒症患者并不发展成ARDS,因此比较和分析感染条件下是否发生ARDS的病理特点是预判ARDS发生的前提。由于ARDS不进行常规肺活检,不具备用大样本量的ARDS肺组织进行相关研究的客观条件。但患者的血常规及外周血白细胞的收集具有便捷性和即时性,深入挖掘患者外周白细胞的转录组特点及分子表型将为ARDS的诊断和预判提供重要的支撑。因此,我们利用生物信息学方法对公共数据库中ARDS患者外周血相关数据进行了再发掘。我们利用生物信息学方法分析脓毒症所致ARDS的关键基因及潜在信号通路以初步探究ARDS患者的异质性问题,尝试寻求不同脓毒症患者发展成ARDS的重要转录因子。方法1.探索PPARγ在小鼠ARDS动物模型中的作用利用脂多糖LPS诱导建立小鼠ARDS动物模型,同时予以PPARγ激动剂、抑制剂刺激,HE染色观察各组肺组织损伤情况;ELISA检测外周血中炎症因子表达;Western blot检测PPARγ及Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ自噬相关标志蛋白的表达。2.筛选和验证对PPARγ有调控作用的Micro RNAs通过生物信息学方法预测靶向作用于PPARγ的Micro RNAs,在LPS诱导的人支气管上皮细胞BEAS-2B细胞炎症模型上进行验证,并对相关指标进行检测。3.分析ARDS患者外周血转录组的特异表征基于公共数据库中脓毒症所致ARDS患者、单独脓毒症患者和正常对照的全血样本进行基于差异表达基因和共表达网络的综合分析,以确定脓毒症发展为ARDS的关键基因和重要信号通路。结果1.PPARγ通过促进自噬和抑制炎症减轻LPS诱导的ARDS小鼠肺损伤LPS成功构建小鼠ARDS模型。同时利用GW9662和吡格列酮分别能够抑制和激活PPARγ。结果显示,GW9662拮抗PPARγ引起炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达升高,肺组织湿干比升高,同时降低自噬相关蛋白Beclin1和LC3II/LC3I的表达水平,进一步加重了肺组织损伤,吡格列酮则刚好呈相反趋势,有效缓解了LPS引起的肺损伤。2.miR-129-5p可以直接结合PPARγ的3’-UTR区生物信息学预测显示miR-129-5p与PPARγmRNA的3’-UTR之间存在靶向结合位点。进一步用双荧光素酶报告证实了miR-129-5p直接靶向PPARγmRNA 3’-UTR。3.LPS通过诱导miR-129-5p抑制PPARγ的表达LPS刺激BEAS-2B细胞成功构建体外细胞炎症反应模型。结果表明,LPS呈剂量依赖性方式抑制BEAS-2B细胞的生长和促进细胞凋亡。同时,LPS促进miR-129-5p的表达水平。此外,LPS呈剂量依赖性方式促进BEAS-2B分泌TNF-α、IL-1β和IL-6。本研究进一步检测了PPARγ和自噬相关蛋白Beclin1和LC3。结果表明,LPS刺激显著降低了PPARγ蛋白的表达,自噬相关蛋白也表现出相同的变化趋势。4.PPARγ介导的自噬显著减轻LPS引起的肺上皮细胞的炎症反应和凋亡我们的研究结果表明,LPS诱导miR-129-5p的上调和PPARγmRNA及蛋白的下调。同时,miR-129-5p抑制剂可促进PPARγmRNA及蛋白的表达。此外,si-PPARγ引起PPARγmRNA和蛋白表达水平下调。PPARγ蛋白及mRNA对miR-129-5p的水平没有显著影响。此外,下调miR-129-5p的表达可促进细胞存活并显著降低细胞凋亡率。PPARγ下调可进一步增加LPS对细胞的损伤。si-PPARγ的共转染阻断miR-129-5p抑制剂对细胞的保护作用。LPS刺激转染miR-129-5p抑制剂可恢复Beclin1蛋白和LC3II/LC3I水平,促进自噬并抑制细胞分泌炎症因子。抑制PPARγ蛋白的表达可以进一步降低Beclin1和LC3II/LC3I的水平来抑制自噬,并阻断miR-129-5p抑制剂对自噬的促进作用和对炎症因子的抑制作用。提示转染miR-129-5p抑制物可提高PPARγ蛋白水平,促进自噬并抑制炎症因子分泌,减轻LPS诱导的细胞凋亡。此外,这种作用被si-PPARγ阻断。5.ARDS患者全血转录组特异性差异基因的识别根据方法部分描述的数据处理过程,我们最终去除了19个样本作为异常值。在原始数据中检测到的47,220个基因,Illumina探针被注释为18,066个蛋白质编码基因,总共确定了439个差异基因（Differential expressed genes,DEGs）。其中,脓毒症单独组和对照组之间鉴定出180个DEGs,ARDS组和对照组鉴定出150个DEGs,脓毒症单独组和脓毒症所致ARDS组之间有162个基因差异表达。6.DEGs的功能和通路的富集分析与DEGs的结果一致,我们观察到脓毒症单独组和ARDS组共享7个GO功能富集和相关信号通路,并表现出一致的调节方向,如中性粒细胞介导的免疫、线粒体相关代谢功能和多巴胺能相关通路。脓毒症单独组特有的功能障碍主要包括线粒体能量代谢过程,如氧化磷酸化、脂肪酸代谢和一些神经通路。ARDS组特有的功能改变主要涉及细胞周期和凋亡相关功能。7.DEGs的相互作用及ARDS预后相关性的分析我们共检测到49个共表达基因模块,基于Pearson相关分析计算了模块-组关系,得到13个与ARDS显著相关的模块,共富集到57个显著的信号通路,包括抗原呈递通路、B细胞发育、Th1/Th2通路、IL-4信号通路等免疫/炎症相关信号通路,以及神经炎症信号通路和脂肪酸代谢通路。与对照组相比,4个基因在脓毒症单独组、脓毒症所致ARDS组均有差异表达,分别是CSF1R、HLA-DRA、IRF8和MPEG1。这四个关键基因的14个上游调控因子,MZF1、EOMES、MGA与hub基因呈显著正相关,LTF、TBX18、TBX5、TBX6与hub基因呈显著负相关。在这些转录因子中,EOMES和LTF显示出组间表达差异的趋势。因此,我们通过ROC曲线分析评估它们的诊断效率,将脱中胚蛋白（eomesodermin,EOMES）、乳转铁蛋白（lactotransferrin,LTF）、集落刺激因子1受体（colony stimulating factor 1 receptor,CSF1R）、人白细胞抗原-DRα（human leukocyte antigen-DR alpha,HLA-DRA）、干扰素调节因子8（interferon regulatory factor 8,IRF8）和巨噬细胞表达1（macrophage expressed 1,MPEG1）作为一个统一的诊断组合,能很好地诊断由脓毒症引起的ARDS。结论ARDS条件下,LPS诱导的miR-129-5p通过与PPARγ3’-UTR区直接结合,抑制PPARγ的表达。降低miR-129-5p或激活PPARγ可显著促进自噬水平,抑制炎症反应,减轻LPS引起的肺损伤。因此miR-129-5p-PPARγ参与的自噬调控可能是ARDS条件下炎症反应及肺上皮细胞损伤的新机制。同时,我们基于显著差异表达基因进行基因共表达网络分析,确定了联合诊断基因标志物组（包括EOMES、LTF、CSF1R、HLA-DRA、IRF8和MPEG1）,并利用受试者诊断曲线评估了它们的诊断效率,证实其对脓毒症及脓毒症所致的ARDS都有很好的诊断能力。