【摘 要】
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[目的]通过脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7制作体外炎症模型,研究骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs）外泌体对RAW264.7细胞高迁移率族蛋白B1（High mobility group protein B1,HMGB1）的表达及作用机制。[方法]1.采用全骨髓贴壁法培养小
【基金项目】
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云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项重点项目NO:2019FE001（-009）；
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[目的]通过脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7制作体外炎症模型,研究骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs）外泌体对RAW264.7细胞高迁移率族蛋白B1（High mobility group protein B1,HMGB1）的表达及作用机制。[方法]1.采用全骨髓贴壁法培养小鼠BMSCs,流式细胞仪鉴定其表面标记物;差速离心法提取小鼠骨髓间充质干细胞外泌体（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells-Derived Exosomes,BMSC-exo）,透射电镜观察 BMSC-exo 形态,纳米颗粒跟踪分析（NTA）检测外泌体浓度及直径分布范围,流式细胞仪及蛋白印迹反应（Western Blot）检测 BMSC-exo 标志物 CD9、CD63、CD81 和 Calnexin的表达;2.构建LPS诱导RAW264.7体外炎症细胞模型:细胞增殖实验（Cell Counting Kit-8,CCK8）检测细胞活力,ELISA方法检测细胞上清液中TNF-α和IL-1β的表达水平,确定LPS作用RAW264.7细胞最佳浓度;3.应用CCK8及ELISA技术进一步确定BMSC-exo作用于RAW264.7细胞炎症模型最佳浓度,正式实验分为4组:Ⅰ.Sham组（正常组RAW264.7细胞）、Ⅱ.LPS组[RAW264.7+LPS（10ng/ml）]、Ⅲ.EXD 组（RAW264.7+LPS+去外泌体上清液）、Ⅳ.EXO 组[RAW264.7+LPS+BMSC-exo（4μg/ml）],去外泌体细胞上清液及 BMSC-exo 溶液均为造模 3h 后给与相同体积,应用 CCK8 实验检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡,Elisa法检测TNF-α和IL-1β表达水平;qPCR和Western bloting检测各组细胞HMGB1,NF-κB的mRNA和蛋白表达水平。[结果]1.流式细胞仪结果显示BMSCs表面标志物CD34、CD45、CD73、CD105 细胞群阳性率为 1.39%、22.1%、81.1%、89.4%;BMSC-exo 透射电镜显示:镜下可见典型杯口状、圆形或椭圆形的囊泡,大小不均一;NTA分析显示囊泡直径分布范围在123 nm-130 nm,样本粒子浓度为1.57×1010particles/ml;western blot结果显示:与BMSCs比较,BMSC-exo中CD9、CD63、CD81蛋白表达水平显著升高（P<0.05）,Calnexin蛋白表达水平显著降低（P<0.05）;流式细胞仪结果显示:CD9、CD63、CD81 和 Calnexin 阳性率分别为:87.87%、81.93%、85.71%、8.04%。各项鉴定结果均显示提取的外泌体为BMSC-exo。2.成功构建RAW264.7细胞炎症模型:CCK8细胞增殖实验和ELISA法探索 LPS 浓度（0.1 ng/ml、1.0 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml、1 μg/ml、10μg/ml）对RAW264.7细胞活力和炎症因子影响,结果确定LPS最佳作用浓度为10ng/ml。CCK8增殖实验和ELISA法确定BMSC-exo对RAW264.7细胞炎症模型最佳作用浓度为4 μg/ml。3.CCK8增殖实验和细胞凋亡结果:与Sham组比较,LPS组、EXD组和EXO组细胞活力降低、细胞凋亡率升高（P<0.05）,与LPS组比较,EXD组和EXO组细胞活力升高、细胞凋亡率降低（P<0.05）,与EXD组比较,EXO组细胞活力升高、细胞凋亡率降低（P<0.05）;ELISA结果:与Sham组比较,LPS组、EXD组和EXO组TNF-α和IL-1β表达升高（P<0.05）,与LPS组比较,EXD组和EXO组TNF-α和IL-1β表达降低（P<0.05）,与EXD组比,EXO组TNF-α和 IL-1β 表达降低（P<0.05）;qPCR 和 Western blot 结果:与 Sham 组比较,LPS组、EXD组和EXO组HMGB1、NF-κB的mRNA和蛋白表达水平升高（P<0.05）,与LPS组比较,EXD组和EXO组HMGB1、NF-κB的mRNA和蛋白表达水平降低（P<0.05）;与EXD组比较,EXO组HMGB1、NF-κB的mRNA和蛋白表达水平降低（P<0.05）。[结论]1.运用全骨髓贴壁法成功在体外培养和扩增小鼠BMSCs;差速离心法、透射电镜、NTA、流式和Western blot成功提取和鉴定BMSC-exo;2.运用LPS诱导RAW264.7细胞成功构建体外炎症模型;3.BMSC-exo和BMSC-EXD均能提高RAW264.7炎症细胞模型细胞活力、降低细胞凋亡,减轻炎症反应,抑制HMGB1及下游NF-κB信号分子表达,BMSC-exo作用效果更佳。
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