食管癌是消化系统恶性肿瘤之一，世界恶性肿瘤发病率中排第7位，死亡率排第6位。食管癌病理类型分为食管腺癌和食管鳞状细胞癌，其中90％为鳞状细胞癌。目前已有多项测序数据揭示了食管癌的基因组改变，为食管癌的发生发展提供了坚实的理论基础，但是由于食管癌患者确诊时大多处于晚期，食管癌从早期发展到晚期的驱动基因及其时序性很难被发现。目前已有的大鼠食管癌动物模型，可获取食管鳞癌从增生到乳头瘤再到食管癌的动态变化的病理组织及测序数据，但其周期较长(＞35周)，并且肿瘤突变负荷较高，难以区分真正的驱动事件。因此，我们急需背景清楚，基因组稳定，易于操作，并且能反映体内真实情况的体外模型来进行食管癌的相关研究。三维类器官是指干细胞或器官特异性祖细胞在特殊的培养条件下，体外增殖分化为与体内器官功能相似的三维立体结构，是一种很好的可替代体内器官水平相关研究的模型。因此，本研究将以大鼠为基础，建立永生化正常大鼠食管上皮细胞系和其3D类器官培养体系，并探究正常食管上皮在体外增殖和分化稳态的调控机制，为食管癌病因学提供基础。
　　本研究成功建立了D3，F3和A1等永生化的正常大鼠食管上皮细胞系，并且D3细胞系的上皮性质与原代细胞更为相似。用D3细胞系成功建立了三维类器官培养系统，D3类器官与正常食管类器官及正常食管组织结构相似，基底层和基底上层标记物CK13，CK14，SOX2和P63等表达也十分相似。2D和3D类器官培养所需的ROCK抑制剂Y27632主要影响细胞增殖，细胞分化等生物学过程和TGF-β信号通路、WNT通路和粘着斑等多个通路，对BMP信号通路无显著影响。去掉ROCK抑制剂之后细胞增殖能力下降，细胞形态变化，3D类器官形成率下降，分化相关基因表达上调，TGF-β信号通路和Wnt信号通路激活。无Y27632的情况下，衰老相关基因p16蛋白表达上调，分化相关基因p63表达下调，ELF3表达上调。敲降P63的结果显示，D3细胞2D增殖能力下降，细胞形态变化，三维类器官的形成率下降，类器官不分化或者分化较差。缺乏P63表达的类器官基底层和基底上层的标记物表达紊乱，SOX表达降低，与基质胶接触的最外层细胞膜E-cad表达消失，与之对应的，分化相关基因NOTCH1和NOTCH3表达下调，ELF3表达上调。敲降ELF3对P63的表达及核定位无明显影响，对增殖也无明显影响。但是敲降ELF3后分化通路的相关基因NOTCH1，NOTCH3和RBPJ表达上调，并且chip-seq数据显示他们是ELF3直接结合的靶基因。
　　本研究成功建立了永生化大鼠食管鳞状上皮和三维类器官培养体系，可作为食管组织的体外替代物，为食管分化调控，食管干细胞标志物以及食管癌病因学等食管相关研究提供基础，并首次发现TP63和ELF3共同调控食管鳞状上皮的增殖和分化稳态。