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普鲁兰酶是淀粉酶中脱支酶的一种,属于糖苷水解酶GH13和GH57家族。它能水解淀粉及寡聚糖中分支点处的α-1,6-糖苷键,在食品行业,医药、洗涤、环保等领域有广泛的应用。本课题组前期从淀粉厂附近的土壤中筛到一株普鲁兰酶的高产菌Klebiellavariicola strain7。经鉴定,该酶为I型普鲁兰酶,其酶活67.8U/mL,目前国内的普鲁兰酶活力水平多处在10～30U/mL,比之国内目前的普鲁兰酶酶活水平有了较大的提高。但是该菌是一种条件致病菌,其发酵液也比较粘稠,不利于后期的提取和纯化,不能应用于食品工业生产。本研究利用基因工程的手段,通过异源表达将该普鲁兰酶基因进行改造,结果如下:1.普鲁兰酶基因的克隆。对野生型菌株Klebiella variicola strain 7提基因组DNA,根据NCBI上公布的相似菌株Klebialla variicolastrain SHN-1的普鲁兰酶基因序列设计一对引物:Nde I-P1,Not I-P2,以原始菌株基因组DNA为模板进行PCR,克隆得到普鲁兰酶基因pul(A),大小为3309bp。将该pul(A)构建到pMD19-T载体上,导入克隆宿主菌大肠杆菌JM109中,提取质粒进行双酶切并测序,证明该重组基因正确。2.普鲁兰酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。制备大肠杆菌BL21感受态,将连到T载体的重组质粒进行双酶切,目的基因构建到pET-21a(+)质粒载体上,得重组质粒pET-21a-pul(A),导入到大肠杆菌BL21(DE3)中,在含有氨苄的固体LB平板上进行筛选,得到一株阳性转化子。3.普鲁兰酶粗酶液纯化。对阳性转化子进行大批量IPTG诱导表达,所得菌体细胞进行低温超声破碎,所得粗酶液进行SDS-PAGE检测,在约120KDa位置处有一明显条带,为目的条带,同时周围有杂蛋白。对粗酶液进行钴离子亲和层析纯化,然后过G-25葡聚糖凝胶柱除盐,最后得到纯酶。4.普鲁兰酶的酶学性质研究。经研究,在大肠杆菌中表达的普鲁兰酶最适温度为45℃,最适pH为5.2,与出发菌株差别不大,但是温度稳定性没有出发菌株的好,45℃保温30min残余酶活不到40%。终浓度为5mmol·L+1的Na+和Mg2+对酶活性有促进作用,Fe3+,Cu2+,Zn2+,SDS,EDTA对该酶有较强的抑制作用。该重组酶的Km值为0.583mg/mL,Vmax为0.65μmol/min/mL,Kcat 值为 12.224/s,Kcat/Km 值为 20.967mL/mg*s。