【摘 要】
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利用脂肪酸脱羧制备烃类生物燃料是开发可再生能源的有效途径。相比于传统化学方法,生物酶法具备高效、低能耗及环境友好等优势,更具有工业化应用前景。光脱羧酶（Fatty acid photodecarboxylase,FAP）是一类专一性强、催化效率高、催化过程无需额外添加昂贵辅因子,仅需利用蓝光即可将脂肪酸转化为烷（烯）烃的光驱动酶,在烃类生物燃料的高效可持续生物合成领域具有显著应用潜能。目前仅有偏好
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利用脂肪酸脱羧制备烃类生物燃料是开发可再生能源的有效途径。相比于传统化学方法,生物酶法具备高效、低能耗及环境友好等优势,更具有工业化应用前景。光脱羧酶（Fatty acid photodecarboxylase,FAP）是一类专一性强、催化效率高、催化过程无需额外添加昂贵辅因子,仅需利用蓝光即可将脂肪酸转化为烷（烯）烃的光驱动酶,在烃类生物燃料的高效可持续生物合成领域具有显著应用潜能。目前仅有偏好催化C12-C20链长脂肪酸的光脱羧酶被报道,其底物选择性机制尚未深入探究。本论文挖掘了来源于绿藻Micractinium conductrix的光脱羧酶Mc FAP,并开展了异源表达及制备、酶学性质表征、催化特性及底物选择性机制等研究。本研究可为光脱羧酶的研发及应用提供科学指导,同时为阐明光脱羧酶的结构功能关系研究提供一定基础。具体开展研究内容及结果如下:（1）光脱羧酶Mc FAP及其突变体Mc FAP-S的制备和催化特性研究。利用全基因合成技术获得了来源于绿藻Micractinium conductrix假定的光脱羧酶基因序列mcfap,同时构建了N端缺失突变体Mc FAP-S（缺失1-550位氨基酸）。在大肠杆菌中实现了Mc FAP-S的异源表达,经镍柱亲和层析纯化Mc FAP-S,产率为121.8 mg·L-1,全长的Mc FAP未能获得纯化的重组蛋白。重组的Mc FAP-S对链长为6-18的饱和直链脂肪酸均有脱羧活性,偏好中链脂肪酸,最适底物为正辛酸（C8:0）（转化率＞99%）。同等反应条件下,Mc FAP全细胞催化软脂酸（C16:0）脱羧的转化率是目前已报道的Cv FAP（来源于Chlorella variabilis）的1.7倍,表明Mc FAP比Cv FAP底物谱范围更广、脱羧效率更高、表达纯化效果更好。（2）光脱羧酶Mc FAP-S酶学性质表征研究。重组的Mc FAP-S催化正辛酸脱羧的最适反应温度为40℃,在40℃孵育6 h后残余酶活力为70.23%;最适p H值为8.0,在p H 8.0孵育5 d后残余酶活力为65.41%;对甲醇、DMSO等有机溶剂及Ni2+、Ca2+等金属离子具有良好的耐受性;4℃避光条件下储存10 d残余酶活力76.74%;考察了不同波长光对Mc FAP-S酶活力的影响,结果发现红光照射3 h后Mc FAP-S残余酶活力为97.22%;在可见光照射下Mc FAP-S与正辛酸共孵育3 h后残余酶活力＞99%。Mc FAP-S在30℃、p H 9.0、加酶量为60μM的条件下催化正辛酸脱羧,反应30 min后产物正庚烷浓度为19.07 m M,转化率为95.34%。（3）光脱羧酶Mc FAP-S的底物选择性机制研究。构建了Mc FAP-S三维结构模型,通过与Cv FAP的三维结构对比分析,推测底物通道口大小对Mc FAP-S底物选择性有重要影响,依据二者对于不同链长底物结合位置的区别,设计了突变体S338V、S338L、S338A、L339I、T340A、T340S、Mc FAP-S338A/L339I/T340S及?344-347。结果显示,S338L仅保留催化软脂酸脱羧活力（为野生型的3.7%）,L339I对正庚酸（C7:0）脱羧活力相较于野生型降低了15%,对月桂酸（C12:0）脱羧活力增加了28%,T340S对正己酸（C6:0）脱羧活力降低了67%,S338A/L339I/T340S对正己酸脱羧活力降低了78%。以上表明S338、L339、T340可能是参与该酶底物选择性调控的关键位点。综上所述,本论文挖掘并研究了来源于绿藻的光脱羧酶Mc FAP,相较已报道的Cv FAP催化特性,Mc FAP具有偏好中链脂肪酸、脱羧活性更高、底物谱范围更广等优势,提高光脱羧酶催化中链脂肪酸脱羧生成C5-C12烷烃的效率,同时初步阐明了Mc FAP的底物选择性机制。
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