背景：类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是慢性,进行性,主要侵蚀外周滑膜关节,以对称性多关节炎为主要临床表现的异质性、系统性、自身免疫性疾病。我国类风湿关节炎的患病率约为0.32%～0.36%,是造成人群丧失劳动力与致残的主要病因之一。流行病学调查显示,类风湿关节炎的发病与性别,年龄,遗传因素,免疫紊乱,环境因素密切相关。类风湿关节炎多发于女性,与男性的比例为3：1。类风湿关节炎80%发病于35-50岁。家系调查发现类风湿关节炎先证者的一级亲属发生类风湿关节炎的概率为11%。对孪生子的调查结果显示,单卵孪生子同时患类风湿关节炎的概率为12%～30%,而双卵孪生子同时患类风湿关节炎的概率只有4%。免疫紊乱被认为是类风湿关节炎主要的发病机制,是以活化的CD4+T细胞和MHC-Ⅱ型阳性的抗原递呈细胞(antigen presenting cell.APC)浸润滑膜关节为特点的。在病程中T细胞和滑膜的巨噬细胞受抗原的刺激而活化,TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等细胞因子增多,关节滑膜处于持续增生炎症状态。炎症破坏关节软骨和骨,造成关节畸形。IL-1、IL-6等引起类风湿关节炎全身性症状如低热、乏力、急性期蛋白合成增多,C反应蛋白和血沉升高。生物制剂如IL-1拮抗剂,IL-6,及TNF-α拮抗剂,CTLA4和CD20单克隆抗体等,在国内外逐渐用于治疗类风湿关节炎,临床试验提示它们有抗炎及防止骨破坏的作用。细胞因子通过激活Janus激酶/信号转导及转录激活因子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)途径而发挥作用,而细胞因子信号转导抑制因子家族(SOCS)是JAK/STAT通路唯一的反馈抑制因子,又被称为细胞的“分子刹车”,在维持机体免疫自稳中发挥重要作用。细胞因子信号转导抑制因子家族一共有8个成员,包括细胞因子诱导SH2结构域结合蛋白(CIS)和SOCS1-7.这些家族成员都是细胞内的一种信号调节蛋白,结构相似,氨基端(N末端)是不同长度的可变区域,中间是一个SH2结构域,羧基端(C末端)是一段保守序列,约40个氨基酸大小的SOCS盒子。人类SOCS3作为SOCS家族一员,最早发现于1997年,基因在染色体上的位置为17q25.3,有两个包含2729个核苷酸的外显子组成。外显子2编码序列由678个连续核苷酸组成,编码225个氨基酸。SOCS3是细胞内的一种信号调节蛋白,正常情况下,SOCS3的mRNA在骨髓和脾等组织,以及外周血细胞表达很低。但在细胞因子或其它刺激物诱导后,SOCS3的mRNA表达上调,其表达方式和时间因刺激因子和所在组织不同而改变。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)系指人类基因组中大量存在的单个核苷酸的差异.核苷酸序列的一定差异决定了不同人种和不同个体的差异,以及不同人群疾病易感性和药物治疗敏感性的差异。因此,SNP是一个具有高度稳定性的遗传学标记,可以成为寻找疾病相关基因,进行疾病诊断、预防和药物筛选的基础。目前,对SNP的检测方法多种多样,如限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异性扩增(ASA)和质谱法等。四引物扩增受阻突变体系PCR(tetra-primer amplification refractory mutation system PCR, tetra-ARMS-PCR)方法扩增的338bp片段的一级结构特征是GC含量高达77%。GC含量高,Tm值就高。高GC含量模板扩增必须用耐热性DNA聚合酶。SNP中其3’端正好与SNP位点重合,由引物的3’端控制着引物的延伸反应,根据延伸产物的长度确定SNP类型。为提高SNP测定的特异性,在特异性引物的3’端倒数第3个碱基引入了一个人为错配碱基,当错配碱基数目达到一定程度同时反应条件达到一定的严谨程度时,3’末端碱基因磷酸二酯键形成困难而不能延伸,反应终止,得不到特异条带,表明没有与之相应的突变,反之则有。所以必须使用缺少3’→5’外切酶活性的Taq DNA聚合酶。设计4条引物进行PCR扩增,其中F1 F2外引物(F,:C-920A-o-F:5’ CCG CGC TCA GCC TTT CTC TGC TGC GA 3’; F2:C-920A-o-R:5’ AGT CCA CAA AGG AGC CTT CGC GCG CG 3’)用于扩增一段含有SNP位点的338bp片段,另一对N1 N2内引物(N1:C-920A-i-F:5’CCC GCA CGC AGC CAG CCG TCC 3’; N2:C-920A-i-R:5’AGC TGG GCC GGG CGG GCG ACT 3’)为SNP位点特异性引物,4条引物在单管中同时进行PCR扩增反应,根据延伸产物的长度确定SNP的类型。其中F1F2扩增的338bp片段,是必须出现的条带；F,N2是210bp,基因型是A；F2N1是170bp,基因型是C。我们研究中国汉族人群SOCS3 5’非翻译区(外显子2)内的-920 C>A(rs12953258)和启动子区的-1044C>A的单核苷酸多态性,以及两个基因位点是否存在连锁不平衡(PDT),即SOCS3的编码序列(-920 C>A)和启动子区(-1044C>A)的连锁关系。目的：研究SOCS3的-1044C>A(外显子2的ATG上游碱基)和-920 C>A(rs12953258)两个位点在中国汉族人群的突变频率,类风湿关节炎患者和健康对照是否存在差异,以及两个位点有无连锁不平衡(PDT),对类风湿关节炎的发病机制和诊断有重要意义。方法1.实验组类风湿关节炎患者100例,全部符合美国风湿病学院(ACR)1987类风湿关节炎的分类标准,对照组健康汉族人100例,性别及年龄相匹配。记录其临床资料,并收集抗凝的外周血2ml。2.提取DNA。3.四引物扩增受阻突变体系PCR检测SOCS3的-920 C>A(rs12953258)位点,用限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)检测SOCS3的-1044C>A位点。电泳,根据电泳条带描述基因型。4.测序。结果：1. 100名类风湿关节炎患者中82名类风湿因子阳性。2. SOCS3的-920 C>A(rs12953258)位点,中国汉族人群类风湿关节炎患者基因型CC3%,AC89%,AA8%；健康对照组基因型CC9%,AC82%,AA9%。3. SOCS3的-1044C>A位点,中国汉族人群类风湿关节炎患者基因型CC100%,ACO%,AAO%；健康对照组基因型CC100%,ACO%,AAO%。4. 200名中国汉族人群SOCS3的编码序列(-920 C>A)和启动子区(-1044C>A)的连锁关系,PDT显示了没有传递不平衡。结论；1. 100名类风湿关节炎患者中82名类风湿因子阳性,其中女性67名基因型是AC59AA6CC2,男性15名基因型是AC12AA2CC1,共计82名基因型是AC71AA8CC3。2.丹麦后裔的高加索人群SOCS3的-920 C>A(rsl2953258)基因型CC92%,ACO％.AA8％.而中国汉族人群类风湿关节炎患者基因型CC3％,AC89％,AA8％；健康对照组基因型CC9％, AC82％.AA9％.说明人种差异。3.丹麦后裔的高加索人群SOCS3的-1044C>A基因型CC99％, AC0％,AA1％.而中国汉族人群类风湿关节炎患者基因型CC100％, ACO％,AA0％；健康对照组基因型CC100％, AC0％.AA0％.4. 200名中国汉族人群SOCS3的编码序列(-920 C>A)和启动子区(-1044C>A)的连锁关系,PDT显示了没有传递不平衡。