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目的: 分析汕头大学医学院第一附属医院临床分离的治疗前后同源的铜绿假单胞菌在无头孢他啶和亚抑制浓度头孢他啶条件下代谢物核磁共振指纹图谱,寻找差异代谢物,结合表型探讨铜绿假单胞菌对β-内酰胺类抗生素可能存在的耐药机制,以及亚抑制浓度的头孢他啶对菌株的影响。 方法: 1.用多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)方法筛选同源治疗前后菌株;微量肉汤稀释法检测治疗前后菌株的最小抑菌浓度MIC;筛选得到实验菌株。 2.测定铜绿假单胞菌在无头孢他啶(ceftazidime, CAZ)和各自的1/2 MIC CAZ、1/4 MIC CAZ条件下的生长曲线;以不影响生长曲线的最高CAZ浓度为治疗前后菌株的亚抑制浓度(SIC)。 3.分别提取治疗前后铜绿假单胞菌在无CAZ和亚抑制浓度CAZ条件下的代谢物,进行核磁共振氢谱(1H-NMR)测定,用主成分分析法(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)进行数据分析,分析差异代谢物。 4.分别检测治疗前后菌株在无CAZ和亚抑制浓度CAZ条件下,在0 M NaCl,0.4 M NaCl,0.8 M NaCl的生长曲线,并进行菌落计数。 5.红细胞溶血实验比较治疗前后菌株在无CAZ和亚抑制浓度CAZ的条件下的的溶血率。 6.结晶紫染色法检测治疗前后菌株在无CAZ和亚抑制浓度CAZ条件下的生物膜形成能力。 7.比较在无CAZ和亚抑制浓度CAZ条件下菌株的丛动、游动和蹭行三种运动能力。 8.分别检测治疗前后菌株在无CAZ和亚抑制浓度CAZ条件下,在0%H2O2,0.1%H2O2的生长曲线,并进行菌落计数。 9.羟苯基荧光素(HPF)荧光染料法比较治疗前后菌株在无CAZ和亚抑制浓度CAZ条件下的活性氧(ROS)水平差异。 10.比色法检测治疗前后菌株在无CAZ和亚抑制浓度CAZ条件下黄嘌呤氧化酶(XO)的活性。 11.显色反应检测治疗前后菌株在无CAZ和亚抑制浓度CAZ条件下过氧化氢酶活性。 结果: 1. MLST分型确定了四对同源治疗前后铜绿假单胞菌,分别以1a,1b;2a,2b;3a,3b;4a,4b命名,治疗后菌株对β-内酰胺的MIC较治疗前菌株增加大于或等于八倍。 2.四对菌株在加入相应的1/2 MIC CAZ与不加CAZ条件下生长曲线无差异,以相应菌株1/2 MIC CAZ浓度为其各自的亚抑制浓度。 3.主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)显示治疗前后菌株无CAZ和亚抑制浓度CAZ条件下其代谢物各自有较为集中的团聚与分离关系,治疗前后菌株在不同条件下均存在差异代谢物。 4.在无CAZ条件下治疗后菌株相对治疗前菌株抗渗透压能力下降,在亚抑制浓度CAZ条件下治疗前后菌株抗渗透压能力均下降。 5.在无CAZ条件下治疗后菌株相对治疗前菌株溶血能力升高,在亚抑制浓度CAZ条件下治疗前后菌株溶血能力均下降。 6.治疗前后菌株在亚抑制浓度CAZ条件下生物膜形成能力均升高。 7.在无CAZ条件下,治疗后菌株相对治疗前菌株丛动、游动、蹭行三种运动能力下降,在亚抑制浓度CAZ条件下治疗前后菌株三种运动能力均下降。 8.在无CAZ条件下,治疗后菌株相对治疗前菌株抗H2O2能力下降,在亚抑制浓度CAZ条件下治疗前后菌株抗H2O2能力均下降。 9.在无CAZ条件下,治疗后菌株相对治疗前菌株ROS升高,在亚抑制浓度CAZ条件下治疗前后菌株ROS均升高。 10.在无CAZ条件下,治疗后菌株相对治疗前菌株XO活性较高,在亚抑制浓度CAZ条件下治疗前菌株XO活性升高幅度较大,而治疗后菌株变化不大。 11.在无CAZ条件下,治疗前菌株相对治疗后菌株过氧化氢酶活性较高,在亚抑制浓度CAZ条件下治疗前后菌株过氧化氢酶活性都升高,且治疗后菌株升高的幅度较大。 结论: 1.同源的治疗前后铜绿假单胞菌菌株在无头孢他啶和亚抑制浓度头孢他啶条件下,存在差异代谢物。 2.治疗后的铜绿假单胞菌与同源的治疗前菌株相比,适应力有所下降而侵袭力并未降低。亚抑制浓度头孢他啶压力下菌株侵袭力明显下降,浮游状态下适应力也明显下降,但形成生物膜风险增加,治疗后铜绿假单胞菌株的反应更为显著。 3.代谢组学是寻找耐药和抗生素选择压力下的应激机制的有力工具。