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背景与目的:糖尿病下肢动脉病变为糖尿病的大血管病变之一,也属于外周动脉疾病（peripheral artery disease,PAD）的重要组成成分。动脉粥样硬化为其主要的病理生理改变,间歇性跛行是其最具特征的临床表现,心血管事件为其主要死亡原因。在中国乃至全球,糖尿病和糖尿病下肢血管病变人群逐年增加,成为极大的社会负担。目前针对糖尿病下肢血管病变的一线无创性检查为测量踝肱指数（ankle-brachial index,ABI）,但由于大多数患者无明显症状以及仪器的普及度不够高,目前存在着PAD的知晓率、诊断率仍较低的情况,因此明确其发病机制、寻求新的临床诊断标志物对于PAD的诊断及治疗尤其重要。脂肪组织现在被认为是一个重要的动态内分泌器官,而不仅仅是过剩能量的被动储存库。它能够分泌多种脂肪因子,例如瘦素、脂联素、成纤维细胞生长因子21（fibroblast growth factor 21,FGF21）等,在调节代谢稳态和多种生理过程中具有关键作用。2016年Romere首次发现白色脂肪组织分泌一种促葡萄糖生成激素—白脂素（Asprosin）。它由FBN1基因编码,在空腹状态下能够增加食欲和诱导肝脏葡萄糖释放,同时具有促进炎症反应和增加内质网应激的作用,从而影响胰岛素信号传递。越来越多的体内体外研究证据表明,白脂素与代谢综合征及心血管疾病紧密相关,但目前白脂素是否参与下肢血管病变的发生及其作用机制还不明确。高血糖导致内皮功能障碍,是糖尿病血管并发症发展的初始过程。损伤后,内皮细胞经历内皮-间充质转化（endothelial-to-mesenchymal transition,EndMT）,失去内皮特异性标记物,并获得间充质细胞表型。在此转分化过程中,内皮细胞之间的紧密连接丢失,与基底膜的附着变弱,伴随其形态的改变,而TGF-β通路是介导EndMT的主要细胞信号。近十年来多项研究表明EndMT在动脉粥样硬化斑块的进展和不稳定中发挥重要作用,但EndMT参与下肢血管病变的机制,及白脂素对EndMT的影响仍不得而知。本文的目的在于:1.明确白脂素是否参与糖尿病患者下肢血管病变2.阐明白脂素在糖尿病患者下肢血管病变的作用及相关机制。材料与方法:本研究分为三个部分,第一部分,收集正常血糖对照组（NC）、单纯2型糖尿病组（DM）及糖尿病合并下肢血管病变组（DM+PAD）病人的一般资料、检查结果和检验结果;并采集各组人群血清,通过人白脂素ELISA试剂盒比较三组间白脂素含量的差异;第二部分,采集三组间患者血清完成非靶向代谢组学检测及相关分析;对2型糖尿病模型鼠db/db鼠及其对照db/m鼠主动脉进行取材并完成转录组测序（RNA-sequencing,RNA-seq）及相关分析;第三部分,使用白脂素重组蛋白干预人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）进行逆转录多聚酶链反应（Reverse transcription and polymerase chain reaction,RT-PCR）、蛋白免疫印迹（western blotting,WB）及免疫荧光实验,探索白脂素诱导EndMT的机制。具体内容如下:1.收集NC、DM及DM+PAD组的一般资料,包括性别、年龄、吸烟史、糖尿病病史、用药史等;记录各组人员的身体质量指数（body mass index,BMI）、腰围、收缩压（systolic blood pressure,SBP）、舒张压（diastolic blood pressure,DBP）、ABI、趾肱指数（toe-brachial index,TBI）等检查数据和空腹血糖（fasting plasma glucose,FPG）、糖化血红蛋白（hemoglobin A1c,Hb Alc）、甘油三酯（triglyceride,TG）、总胆固醇（total cholesterol,TC）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C）、超敏C反应蛋白（high-sensitivity C-reactive protein,hs-CRP）等检验数据;使用相关统计学方法分析三组间各项资料的差异。2.使用ELISA试剂盒测量血清白脂素含量并比较三组间差异。3.使用Spearmen相关分析白脂素含量与ABI和TBI之间的相关性,并构建一元及多元线性回归模型。4.使用一元及多元logistic回归模型建立白脂素对PAD的预测模型,并建立受试者工作特征（receiver-operator characteristic,ROC）曲线,评估白脂素对PAD的预测效率及寻找预测PAD的最佳切点及其敏感性和特异性。5.通过代谢组学结果进行三组间one-way ANOVA筛选、DM+PAD vs NC和DM+PAD vs DM差异代谢物质的交集、DM vs NC和DM+PAD vs DM差异代谢物质的交集,对以上差异物质分别进行代谢通路富集分析。6.对db/db vs db/m鼠主动脉样本RNA-seq结果中上调和下调的基因进行相关通路富集分析。7.使用白脂素干预人脐静脉内皮细胞后通过RT-PCR、WB、免疫荧光等实验检测其内皮细胞标志物的表达和肌成纤维细胞标志物的表达,并采用TGF-β特异性抑制剂验证白脂素是否通过TGF-β信号通路诱导EndMT。结果:1.三组间年龄、性别比、BMI及腰围相匹配,DM与DM+PAD组间吸烟史、糖尿病病程、降糖药使用率之间无差异,但其余药物使用比例DM+PAD高于DM组;与NC组比较,DM组和DM+PAD组SBP、FPG、Hb Alc、TG显著升高,DBP、HDL-C显著降低;DM+PAD组较DM组hs-CRP显著升高及ABI、TBI显著降低,但两组间血压、血糖、血脂水平无明显差异。2.DM+PAD组白脂素水平显著高于另外两组,但DM组和NC组间无明显差异。3.通过Spearmen相关性分析,发现白脂素与ABI和TBI均呈显著负相关,在校正传统PAD危险因素后的线性回归模型中,白脂素仍保留与ABI的相关性。4.多元logistic回归模型中白脂素仍为PAD的独立危险因素,绘制ROC曲线下面积为0.788,敏感度为74.5%,特异性为74.6%,最佳切点值为188.70 ng/ml,反映了白脂素对PAD具有良好的预测作用。5.代谢组学揭示了氨基酸代谢紊乱是PAD患者代谢的主要特征,提示肌成纤维细胞在产生胶原蛋白时发生了代谢重编程和从头氨基酸合成,同时伴随着TGF-β信号通路的激活。6.db/db vs db/m上调基因有1049个,下调基因有1043个,总共2092个基因相关通路富集于细胞外基质受体相互作用、心肌受损、平滑肌收缩等,提示2型糖尿病鼠存在着血管重塑及血管收缩增强,其中TGF-β信号通路参与调控,并且TGF-β信号通路仅存在于上调基因的富集分析中,不存在于下调基因中。7.使用白脂素重组蛋白干预HUVECs后,RT-PCR和WB结果均提示内皮细胞标志物,如CD31、vwf、Nos3等表达下降;肌成纤维细胞标志物,如α-SMA、TAGLN、collagen I、CTGF等表达上升;免疫荧光结果也证实了内皮细胞向肌成纤维细胞方向转化。TGF-β特异性抑制剂SB431542消除了白脂素产生的影响。结论:1.白脂素与糖尿病下肢血管病变的发生密切相关,可能取决于其在动脉的局部作用。2.白脂素激活TGF-β信号通路诱导EndMT,进而参与糖尿病患者下肢血管病变。