论文部分内容阅读
心肌肥厚是高血压等多种心血管疾病进展到后期的明显病理改变,是心力衰竭的关键环节,由心肌肥厚而心衰,由心衰而死亡是导致病人死亡的主要原因;此外,心肌肥厚还是恶性心律失常以及心源性猝死的独立危险因素。但因心肌肥厚的发病机制尚未完全阐明,迄今为止仍缺少针对性的有效防治药物。因此,开展心肌肥厚防治药物的研究成为当务之急。G蛋白在心肌肥厚的形成中发挥了重要的信号转导作用。因此,针对G蛋白设计特异性阻断药物则会具有良好的改善作用。G蛋白抑制肽（G alpha q-protein carboxyl ter minus imitation polypeptide,GCIP）是我室针对Gαq分子自主研发的多肽药物,已经取得中国、美国、欧盟、印度以及日本的发明专利授权。本室既往研究发现腹腔注射GCIP对去甲肾上腺素（Norepinephrine,NE）诱导的小鼠心肌肥厚模型、自发性高血压大鼠模型、阿霉素诱导的大鼠心力衰竭等模型均具有良好的改善作用。然而,腹腔注射存在疼痛、无法自主给药等缺陷,难以适应临床需求。因此,本文通过建立NE诱导的小鼠心肌肥厚模型,皮下注射GCIP以探索新的有效给药途径。盐敏感性高血压是由于相对高盐摄入引起的血压升高,占我国北方人群的58%。尽管GCIP对多种心肌肥厚模型具有良好的防治作用,但GCIP对盐敏感性高血压所致的心肌肥厚仍尚待研究。因此,本文拟通过建立DOCA-高盐诱导的盐敏感性高血压模型,研究GCIP的改善作用及潜在机制,进而为GCIP的研发提供新的实验依据。连翘是我国的传统中药,中医药古籍记载其具有清热解毒,消痈散结及调节血压等功效。连翘苷（Phillyrin,PHI）则是从连翘中分离的单体小分子化合物,具有抗炎、抗氧化、抗病毒、改善脂质沉积等药理作用。加之,本室既往研究发现PHI可明显抑制肝星状细胞的活化及NF-κB信号通路,对于肝脏纤维化及炎症反应具有良好的改善作用;提示连翘苷可能具有改善心肌肥厚的药理作用,但目前为止仍未有研究对此进行报道。为此,本文一并探索了连翘苷对心肌肥厚的作用及初步机制。方法1.NE诱导小鼠心肌肥厚的模型建立及GCIP干预雄性C57BL/6小鼠每日2次皮下注射NE（1.5 mg/kg）,连续15天,即可建立小鼠心肌肥厚模型。同时每日1次皮下注射0.1 mg/kg和1 mg/kg的GCIP,以及每日1次腹腔注射哌唑嗪5 mg/kg连续15天。采用小动物超声成像系统、ELISA、H＆E染色、WGA染色等方法,研究皮下注射GCIP对心肌肥厚的改善作用2.DOCA-高盐诱导小鼠心肌肥厚模型的建立及GCIP给药雄性C57BL/6小鼠单侧肾切除术后,恢复7天,通过喂养高盐水及每2日皮下注射DOCA（100 mg/kg）连续28天,即可构建小鼠心肌肥厚模型。同时每日2次,皮下注射0.1 mg/kg、0.3 mg/kg、1 mg/kg的GCIP或生理盐水。最后采用小动物超声成像系统、小动物血压仪、H＆E染色、WGA染色、蛋白质免疫印迹法研究GCIP对心肌肥厚的改善作用及潜在机制。3.NE诱导体外心肌肥大模型的建立及PHI干预通过4μM NE刺激H9C2心肌细胞建立心肌肥厚体外模型。通过CCK-8法、免疫荧光法、流式细胞术、蛋白质免疫印记等方法,评价PHI在体外对NE诱导心肌细胞肥大的抑制作用及潜在机制。4.NE诱导小鼠心肌肥厚模型的建立及PHI给药雄性C57BL/6小鼠每日2次皮下注射NE（1.5 mg/kg）,连续15天,即可建立小鼠心肌肥厚模型。同时每日1次,腹腔注射30 mg/kg和100 mg/kg的PHI或同体积的生理盐水。采用小动物超声成像系统、ELISA、H＆E染色、WGA染色、RT-PCR、蛋白质免疫印记法研究PHI对心肌肥厚的改善作用及机制。结果1.在NE诱导的小鼠心肌肥厚模型中,皮下注射GCIP能够明显提高小鼠左心射血分数（P＜0.05）、降低血清中NT-pro BNP的含量（P＜0.05）、降低小鼠心脏肥厚指数（P＜0.01）以及改善心脏组织的病理性损伤。2.在DOCA-高盐诱导的小鼠心肌肥厚模型中,皮下注射GCIP能显著提高小鼠生存率（P＜0.05）、降低血压（P＜0.05）、提高左心射血分数、左心室短轴缩短率（P＜0.05）以及改善心肌肥厚和纤维化。此外,GCIP能够抑制α-SMA的表达和p38、ERK1/2的磷酸化（P＜0.001）。3.在NE诱导的体外心肌细胞肥大模型中,0.1～10μM PHI对心肌细胞活力无影响。此外,PHI能够直接抑制心肌细胞肥大（P＜0.001）、抑制细胞中ROS含量（P＜0.05）以及降低p38、ERK1/2、AKT及NF-κB的蛋白磷酸化水平（P＜0.001）。4.在NE诱导的小鼠心肌肥厚模型中,PHI能够明显提高小鼠左心射血分数、左心室短轴缩短率（P＜0.05）、降低血清中NT-pro BNP的含量（P＜0.05）、降低小鼠心脏肥厚指数（P＜0.001）、改善心脏组织的病理性损伤、抑制肥厚基因和炎症基因的表达（P＜0.001）以及降低p38、ERK1/2、AKT及NF-κB的蛋白磷酸化水平（P＜0.01）。结论1.皮下注射GCIP对NE及DOCA-高盐诱导的小鼠心肌肥厚具有良好的改善作用,其机制与抑制p38/ERK1/2信号通路有关。2.PHI对于心肌肥厚具有较好的改善作用,作用机制可能与抑制p38/ERK1/2和AKT/NF-κB信号通路有关。