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外周动脉疾病是继冠心病、卒中之后死亡率最高的由动脉粥样硬化所致的疾病,主要表现为下肢动脉硬化闭塞症（Arteriosclerosis obliterans,ASO）。统计结果表明,在中国年满35周岁及以上人群中,患有ASO的人口数占6.6%（约4500万人）。年龄偏大、汉族、吸烟、高血压、高血糖、高血脂、受教育程度低等因素都可能增加患ASO的风险。ASO可导致间歇性跛行、慢性肢体缺血甚至组织损伤,严重时可能导致截肢甚至危及生命。随着我国经济增长、城市化和人口老龄化,动脉粥样硬化性心血管疾病的负担正在迅速增加,而现有的腔内治疗、开放性手术治疗和药物治疗等治疗手段效果不明显,寻找新的治疗方法迫在眉睫。目前的研究表明,血管壁的慢性炎症是动脉粥样硬化形成的一个主要和独立的因素。然而,其分子和细胞途径尚未完全阐明。参与先天免疫反应的细胞,尤其是单核/巨噬细胞,通过参与泡沫细胞形成、介导细胞因子释放、与内皮细胞和平滑肌细胞相互作用等关键途径促进动脉粥样硬化形成,调节斑块的稳定性。Toll样受体（Toll-like receptor,TLRs）是先天免疫系统的重要组成部分,已有研究发现TLRs在巨噬细胞参与的多个动脉粥样硬化病理过程中均起到关键作用。其中TLR4被认为动脉粥样硬化过程关键启动子之一。作为一系列核转录因子κB（nuclear factor-κB,NF-κB）依赖型炎症反应的活化剂,TLR4的过表达可能导致促炎细胞因子和趋化因子的过度释放,比如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素1β（interleukin-1β,IL-1β）、IL-6、γ干扰素（interferon-γ,IFN-γ）,而这些将直接影响动脉粥样硬化的进展。因此,从调控TLR4信号通路方面来寻找新的抗动脉粥样硬化药物理论上是一个可行的思路。柯里拉京是一种从叶下珠属植物中提取的鞣花丹宁单体,具有丰富的药理作用。值得关注的是,柯里拉京可以抑制经典炎症模型和单纯疱疹病毒性脑炎模型中TLR4信号通路。但目前为止,柯里拉京是否能在动脉粥样硬化中发挥其抗炎作用从而抑制病情进展,这一点尚未被报道。因此,本研究拟利用细胞实验来研究柯里拉京对动脉粥样硬化细胞模型中TLR4信号通路的影响,并在动物实验中加以验证,并探究柯里拉京对ASO动物模型的治疗效果和TLR4信号通路在其中发挥的作用。第一部分柯里拉京对Ana-1细胞系及小鼠原代腹腔巨噬细胞模型中TLR4信号通路的影响目的:探究柯里拉京对动脉粥样硬化巨噬细胞模型中TLR4信号通路各分子表达水平的影响及柯里拉京可能的作用靶点。方法:用CCK8法测定柯里拉京最大无毒浓度。以ox-LDL刺激Ana-1巨噬细胞系或者小鼠原代腹腔巨噬细胞（Mouse Peritoneal Macrophages,MPMs）构建动脉粥样硬化细胞模型,再用安全范围内不同浓度的柯里拉京进行干预,用q RT-PCR法和Western Blot法测定TLR4及下游Toll-白细胞介素1受体C功能区接头蛋白（toll-interleukin 1receptor domain-containing adaptor protein,TIRAP）、髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88,My D88）、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNF receptor-associated factor,TRAF6）、丝裂原活化蛋白激酶p38（mitogen activated protein kinase p38,p38）、NF-κB基础调节蛋白（NF-κB essential modulator,NEMO）、干扰素调控因子5（interferon regulatory factor 5,IRF5）的转录和翻译水平。采用小分子干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）和慢病毒载体来下调或上调细胞中TLR4分子后,检测下游各分子表达水平的改变情况,并观测柯里拉京的干预对各分子表达水平的影响。结果:经CCK8法测定后模拟细胞生存曲线,计算得柯里拉京IC50=215.86μg/ml,在保证细胞存活率>70%的前提下,本实验所用浓度为100、50、25μg/ml。Ana-1和MPMs经Ox-LDL刺激后,TLR4及下游TIRAP、My D88、TRAF6、p38、NEMO和IRF5的转录和翻译水平明显增高,柯里拉京可以显著抑制这种增高趋势。TLR4分子下调或上调后,下游分子分子均出现不同程度的下调或上调,各分子变化趋势一致。在TLR4下调或上调的细胞中,柯里拉京同样可以抑制由ox-LDL介导TLR4信号通路各分子的过表达。结论:Ox-LDL可以激活巨噬细胞TLR4通路,提高通路中TLR4及下游TIRAP、My D88、TRAF6、p38、NEMO和IRF5的表达水平。同时,TLR4对下游分子的表达具有正反馈调节作用。柯里拉京可以有效抑制动脉粥样硬化细胞模型中TLR4通路各分子的过表达,阻碍通路的信号传导,其作用靶点可能即为TLR4。第二部分柯里拉京对ASO大鼠粥样斑块及外周血巨噬细胞TLR4信号通路的影响目的:探究柯里拉京对ASO大鼠巨噬细胞TLR4信号通路的影响和对股动脉斑块的干预作用。方法:42只SD大鼠随机分为7组,分别为空白对照组、假手术组、模型组、柯里拉京高、中、低浓度组、阿司匹林组（阳性对照组）;除空白组和假手术组外,其余各组均进行手术操作,股动脉内灌注无菌蒸馏水,利用细胞外低渗透压使动脉内皮细胞遭到破坏,术后再予以高脂高胆固醇饮食喂养4个月,以建立ASO大鼠模型。从第四个月起,用灌胃法予以柯里拉京或阿司匹林进行干预。干预后收集大鼠外周血,提取单个核细胞,利用q RT-PCR、Western Blot、流式细胞术等方法测定各组细胞中TLR4、TIRAP、My D88、TRAF6、p38、NEMO和IRF5的表达水平。分离提取血浆,用ELISA法检测IFN-γ、IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平。收集各组大鼠股动脉标本,制成切片并用油红染色,观测柯里拉京对粥样斑块的影响,免疫荧光染色观测病变区TLR4分子表达情况。结果:经手术破坏股动脉内膜和高脂高胆固醇饮食喂养后,大鼠股动脉出现明显粥样斑块,并且可观察到斑块内大量TLR4分子表达。不仅如此,外周血巨噬细胞中TLR4信号通路各分子也呈现高表达状态。而柯里拉京的干预可以明显降低斑块所占管腔面积百分比,并且显著降低病变区域TLR4表达水平和外周血巨噬细胞中TLR4信号通路各分子的表达水平。对应的,模型组血浆中IFN-γ、IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平明显增高,而柯里拉京对这种过表达有明显抑制作用。结论:巨噬细胞TLR4信号通路各分子的高表达与大鼠股动脉粥样硬化的发生发展有关。ASO大鼠中,TLR4信号通路被激活,信号传导至下游被最终促进IFN-γ、IL-1β、IL-6、TNF-α等促动脉粥样硬化因子的释放,导致动脉粥样硬化的形成和发展。柯里拉京可以有效抑制TLR4信号通路,使上述促动脉粥样硬化因子的释放明显减少,从而减缓动脉粥样硬化的进程。