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本研究主要是通过收集BPES家系外周静脉血并提取DNA,利用聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)进行FOXL2基因片段的扩增,将其产物经过纯化后根据Sanger双脱氧链末端终止法进行基因测序及序列分析,利用NCBI网站上BLAST功能将所测的FOXL2序列与其原始序列的碱基进行比对,从而可知所测BPES患者的FOXL2基因序列改变情况。通过对FOXL2基因的测序研究,明确FOXL2基因突变在BPES发病中的作用,从而在基因及分子水平阐明BPES的发病机制,为今后在基因水平上阻止BPES的发生提供新的理论依据。
目的:对中国人小睑裂综合征家系患者致病候选基因——FOXL2基因的突变进行研究,寻找新的突变位点;推测FOXL2基因突变后引起的蛋白改变,阐明BPES的可能发病机制。
方法:1.对所收集的4个BPES家系和部分散发病例共25名患者进行临床检查与诊断,确定其疾病的类型,排除其他的局部或全身的遗传性疾病;
2.对BPES的患者25人和家系非患者50人及正常人50人抽取外周血,每人约3-5ml并予EDTA抗凝后进行基因组DNA的提取;
3.根据GenBank获得FOXL2原始序列,应用软件PRIMEREXPRESS2.0设计扩增片段的引物,然后合成相应的引物;
4.应用聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)进行产物的扩增与纯化;
5.根据Sanger法进行FOXL2基因的测序及分析,利用相关软件确定所测FOXL2基因序列的突变情况及其相应的氨基酸改变,从而推测蛋白的改变;
结果:1.在一个五代Ⅱ型BPES家系中,其患者的FOXL2基因测序图显示:碱基g.983的胞嘧啶C和g.984的鸟嘌呤G之间有一个胸腺嘧啶T的插入,即g.983-984insT;此外,移码突变点后有多个点突变,即g.1082A>C、g.1084T>G、g.1092T>G、g.1042A>G、g.1044A>C、g.1057A>T、g.1077A>G、g.1088A>C、g.1100G>C、g.1101A>G和g.1102G>C;该家系中正常人、其他BPES家系和对照组均未发现与该家系相同的基因改变;
2.利用BCMSearchLaunch程序软件进行突变FOXL2基因的氨基酸序列的确定,结果显示由于第983碱基以后的发生T碱基的插入导致遗传密码子的移码,使插入点后所翻译的氨基酸序列全部发生改变,在原始序列终止密码子的地方,翻译过程仍继续进行,最后导致了FOXL2核蛋白的延长;
3.本研究中,BPES患者的FOXL2基因序列中均尚未发现与国内外已报道的相同基因突变位点;
结论:1.本研究中发现的FOXL2基因的新突变点g.983-984insT,在国内外均未见有报道;
2.FOXL2基因突变是BPES的致病候选基因,研究中发现的FOXL2基因移码突变导致翻译蛋白的延长可能是中国人Ⅱ型BPES的发病原因。