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目的在构建重组质粒pcDNA3.1-HBx和pEGFP-N1-Kras的基础上,采用直接注射的方法,将脂质体包裹的重组质粒注入动物睾丸中,探讨利用睾丸内生精小管微注射精子载体法建立转HBx、突变Kras基因树鼩的可行性,为建立转HBx、突变Kras基因树鼩肝癌动物模型并进一步研究两种基因在肝细胞癌发生发展过程中的作用打下基础。方法首先用多聚酶链式反应(PCR)扩增含NheⅠ和KpnⅠ酶切位点的Kras基因序列,对pEGFP-N1载体及Kras基因PCR产物双酶切,用连接酶将两者连接并转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,并对其进行双酶切和测序鉴定,构建Kras基因真核表达载体pEGFP-N1–Kras;成年雄雌树鼩按1:1或1:2配对,根据动物间的适应和受孕情况调整成相对固定的繁殖对。给所有动物建立档案,记录树鼩的生产情况,计算母树鼩的总产仔数、平均年产仔数及平均每次妊娠的合笼天数。记录仔动物的每日体重、进食量和健康情况。对仔树鼩用三种方法进行喂养,即配方乳喂养、被动和主动母乳喂养。16只雄性成年树鼩随机分为pcDNA3.1-HBx组、pEGFP-N1-Kras组、pcDNA3.1-HBx + pEGFP-N1-Kras组和生理盐水对照组,利用脂质体2000包裹已构建的pcDNA3.1-HBx和pEGFP-N1-Kras重组质粒,按3:1比例混合(V/W),DMEM稀释后按分组用微量注射器多位点注射入16只雄性树鼩睾丸,每周一次,连续注射四次后再隔三周与成年雌性树鼩合笼自然交配。对合笼交配后4个月内生产的仔树鼩进行肝活检,提取活检肝组织总DNA,PCR技术对基因整合进行鉴定,免疫组化检测其蛋白表达情况。C57BL/6小鼠转基因试验方法同树鼩,剪取一周龄仔鼠尾巴提取总DNA,PCR检测目的基因。结果双酶切pEGFP-N1-Kras后,琼脂糖电泳可分别见到大小约为567bp的片段和几kb的大片断,说明Kras亚克隆入pEGFP-N1,经序列测定其含有完整的Kras基因片段; 20个月的实验期内共进行三次转基因后的雄性树鼩,均具有正常的繁殖能力,三轮实验观察期内共生产仔树鼩128只,其中成活58只。仔树鼩存活率为45.3%;PCR检测128只仔树鼩肝、肾等组织中的HBx基因,其中4只为阳性(单独注射组3只,联合注射组1只)。PCR产物经DNA测序证实为HBx基因。阳性率为3.57%。EGFP基因均为阴性。经转基因后的小鼠12个月的观察期内共获得HBx基因阳性动物3只(单独注射组2只,联合注射组1只),EGFP基因阳性动物1只(联合注射组)。对活检肝组织进行常规HE染色和免疫组化检测,显示3只树鼩(E9478、E9242、E9256)部分肝细胞有HBxAg阳性颗粒分布。两只树鼩(E9260、E9252)活检肝组织出现EGFP蛋白表达。结论成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Kras;睾丸内注射精原细胞介导法构建转HBx基因树鼩动物模型是可行的,用此方法建立转突变Kras基因树鼩是否可行还需进一步研究。