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研究背景与目的:在人体内各种类型的消化道肿瘤中,结直肠癌具有相当高的发病率,已然成为人类身体健康的重大威胁之一。而在我们的国家,随着人民群众生活习惯以及饮食结构的改变,结直肠癌的发病率较以前明显升高,并且有逐年上升的趋势。手术切除是目前治疗结直肠癌最主要的方法,同时辅助以放化疗,但是5年生存率仍难以令人满意,究其原因,肿瘤的复发和转移占很大比例。近年来分子靶向治疗在癌症的研究中越来越受到重视,因此,寻找新的有效方法抑制结肠癌细胞的增殖、转移是治疗结肠癌新的研究方向,其中结直肠癌细胞增殖、转移相关的信号通路就是一个新的热点。cAMP在人体内广泛分布,作为细胞重要的第二信使之一,其在细胞增殖、分化、凋亡以及转移等多种病理生理过程中起着十分重要的作用,而其具体的机制有可能与下游相关靶蛋白表达水平的改变有关,例如与细胞周期和细胞增殖有关的蛋白CyclinD1,以及与细胞侵袭转移有关的蛋白MMP9。传统研究认为cAMP的信号由PKA-Rap1信号通路介导,但近年来研究表明其也可以通过Epac-Rap1信号通路介导。Epac蛋白有2个亚型:Epac1、Epac2。Epac1在体内广泛表达,并且cAMP/Epac1介导的信号可以对多种肿瘤细胞的增殖、转移过程产生作用。而Epac2主要在神经元、胰岛β细胞、肾上腺、垂体等组织中表达,很少有文献报道其与肿瘤的发生、发展相关。因此,cAMP/Epac1信号通路可能是肿瘤发生、发展过程中非常重要一个的环节。虽然cAMP/Epac1信号通路与多种类型的肿瘤的增殖、转移过程有关,但到目前为止尚无文献报道cAMP/Epac1信号通路参与调控结直肠癌细胞的增殖、转移过程。因此,本实验通过抑制cAMP/Epac1信号通路活性进而探索其在结肠癌细胞增殖、转移过程中所起的作用以及可能涉及的机制。研究方法:第一部分:Wsetern Blot筛选Epac1高表达的结肠癌细胞株在本实验中,将人类结肠癌细胞株Caco2、SW480、SW620作为研究对象,各种细胞均用含有10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基培养。采用Western Blot的方法检测每种结肠癌细胞株中Epac1的表达情况,并选出Epac1高表达的结肠癌细胞株作为后续的实验对象。第二部分:探索Epac特异性抑制剂ESI-09抑制cAMP/Epac1信号通路活性后,结肠癌细胞增殖、转移能力的变化及可能的机制。1.MTT法检测ESI-09对结肠癌细胞增殖活性的影响:结合相关文献数据,设置5个ESI-09浓度组(1 umol/L、2.5 umol/L、5 umol/L、10 umol/L、20 umol/L),并设置三个时间梯度:12、24、48小时,然后用MTT法检测ESI-09在各时间-浓度梯度对结肠癌细胞增殖活性的影响。根据MTT结果,给予不同浓度梯度的ESI-09(0 umol/L、5 umol/L、10 umol/L、20 umol/L)分别干预结肠癌细胞12、24、48小时后,通过划痕实验检的方法测定各个ESI-09浓度组结肠癌细胞的迁徙能力。3.流式细胞仪(FCM)检测结肠癌细胞细胞周期的分布情况:在ESI-09(20 umol/L)干预结肠癌细胞24小时后,用FCM检测结肠癌细胞细胞周期的分布。4.Western Blot检测结肠癌细胞相关信号通路改变:不同浓度梯度ESI-09(0 umol/L、5 umol/L、10 umol/L、20 umol/L)干预结肠癌细胞24小时后,通过Western Blot检测结肠癌细胞中p-AKT、AKT、CyclinD1、MMP9的表达情况。第三部分:探索siRNA抑制Epac1表达后,结肠癌细胞中CyclinD1和MMP9表达水平的改变:转染Epac1-siRNA干扰序列后,通过Western Blot检测结肠癌细胞中CyclinD1、MMP9的表达。实验结果:1.人结肠癌细胞株SW620、SW480、Caco2均有Epac1表达,其中SW620细胞株中Epac1表达较SW480、Caco2细胞株低,且差异具有统计学意义(P<0.05);而在SW480和Caco2细胞株中,Epac1的表达无统计学差异(P>0.05)。然后采用随机抽样的方式,选取Caco2细胞株作为后续试验的研究对象。2.ESI-09在作用于Caco2细胞12小时时即可观察到增殖抑制效果。ESI-09在1umol/L时,ESI-09对Caco2细胞没有明显的增殖抑制作用,但是当浓度上升至2.5umol/L~~20umol/L的范围时,ESI-09能够显著地抑2.划痕实验检测细胞迁徙能力:制Caco2细胞增殖,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),并且Caco2细胞的增殖率随ESI-09浓度的增高而降低。3.同浓度梯度-时间梯度的ESI-09干预后,Caco2细胞迁徙能力较对照组明显下降。4.与对照组相比,在ESI-09干预后的结肠癌Caco2细胞周期分布中,G1期细胞所占的比例显著增高(P<0.05),而S、G2期细胞所占的比例降低(P<0.05)。5.ESi-09能够降低结肠癌Caco2细胞CyclinD1、MMP9的表达以及AKT的磷酸化水平(P<0.05),并且呈浓度依赖性。6.与空载组及对照组相比,Epac1-siRNA转染Caco2细胞后,细胞中CyclinD1和MMP9的表达水平显著降低(P<0.05)。结论:1.抑制cAMP/Epac1信号通路可以抑制结肠癌细胞的增殖活性、降低结肠癌细胞的转移能力。2.cAMP/Epac1信号通路可以作为结肠癌潜在的新治疗靶点。