【摘 要】
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以E.coli MC4100染色体DNA为模板用PCR扩增技术克隆了鸟苷酸还原酶基因guaC,该基因位于大肠杆菌K-12株染色体的2.6分钟处,该基因全长1044bp,编码了分子量为37kD的蛋白质.将该
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以E.coli MC4100染色体DNA为模板用PCR扩增技术克隆了鸟苷酸还原酶基因guaC,该基因位于大肠杆菌K-12株染色体的2.6分钟处,该基因全长1044bp,编码了分子量为37kD的蛋白质.将该基因直接克隆于pET16-b质粒的T7启动子下游,得到了质粒pEXP1.转化E.coli BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,获得了高效的表达.含表达质粒的菌体的胞内粗提液经酶活分析表明,鸟苷酸还原酶的活性为不含质粒的宿主菌的80~85倍.另一方面,为了获得鸟苷酸的积累,针对大肠杆菌体内的鸟苷酸代谢途径,进行了guaC基因敲除的探索工作.为了获得较好的同源整合的效率,在被灭活的目的基因guaC基因的两侧进行了PCR扩增,以获得较长的同源序列.与此同时建立了筛选同源整合菌株的模型并且确立了筛选同源整合菌株的条件.
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