脂质代谢紊乱所导致的高脂血症(Hyperlipemia)与人类心脑血管疾病的发病有着密切的关系,已成为对人类生命健康产生重要影响的致病因素。根据《中国成人血脂异常防治指南(2016年修订版)》显示,中国总体血脂异常患病率高达40.4%。据相关数据监测显示,2016年调血脂类药物总体销售额高达211.65亿元,并呈整体上升趋势。随着社会人口老龄化速度加快以及慢性病管理体系的健全发展,预计未来调血脂药物仍是心脑血管类药物的主流产品。市场上流行的调血脂药物有HMG-CoA还原酶抑制剂、烟酸类、贝特类、胆固醇吸收抑制剂、胆酸螯合剂、PCSK9抑制剂和鱼油不饱和脂肪酸制剂,其中应用最广泛的是他汀类药物,但他汀类药物存在与肝、肾及体内代谢相关的不良反应,以及胃肠反应、鼻炎、头痛、肌肉毒性等多种毒副作用。因此,从天然药物中发现低毒、高效的天然调血脂药物成为新的研究方向。贻贝多糖(musselpolysaccharideα-D-glucan,MP-A)具有免疫力调节、抗肿瘤、抗氧化等多种生物学活性,因其主链与淀粉主链相同,所以推测以α-1,2-糖苷键连接的支链是发挥生物学活性的有效形式。由于MP-A是一种不能被肠道吸收的生物大分子,所以本课题将采用酶解法对MP-A进行降解,得到贻贝寡糖MOS-1,探究其降血脂活性及其作用机制,为后续的贻贝寡糖MOS-1开发及临床应用提供理论依据。(1)MOS-1的制备工艺研究酶解法具有高效性、底物专一性、条件温和的特点,在本研究中,首先对原有的酶解工艺进行了优化。在相同水解条件下,对比了同样作用于α-1,4-糖苷键的中温α-淀粉酶和糖化酶对MP-A的酶解效果,进而对酶解条件(酶浓度、多糖浓度、酶解时间)、酵母除单糖条件(酵母浓度、反应时间)和乙醇沉淀倍数等进行了优化,最后得到了酶解最优工艺,具体为:配制10 g/LMP-A溶液,调pH为5.2,加入中温α-淀粉酶使其终浓度为5 g/L,搅拌均匀反应,沸水浴15 min,过滤收集滤液,按照4g/L浓度加入酵母干粉,150rpm、30℃摇床培养20h,过滤去除菌体,加入10倍体积乙醇去除MP-A,浓缩上清至原溶液体积,得到MOS,最后利用串联凝胶层析分离出MOS-1。利用中温α-淀粉酶酶解法可得到聚合度较为广泛的寡糖种类,但是后续酶解产物的分离纯化过程较为复杂,而且中温α-淀粉酶水解过程所需温度较高,容易与糖类成分产生美拉德反应,导致MP-A水解液的非酶褐变。为了简化MP-A降解步骤、减小酶解过程中底物反馈抑制作用,将来源于青霉菌(Penicilliumsp.)的低温淀粉酶基因Amy进行毕赤酵母密码子偏好性优化,全基因合成后,把低温淀粉酶基因Amy整合到毕赤酵母表达系统,构建了重组毕赤酵母SMD 1168H-Amy,筛选并验证了阳性转化子。将重组菌株扩大培养,收集菌体后,放入MP-A溶液中进行酶解过程,后续通过过滤去除酵母、乙醇沉淀未降解的MP-A和凝胶层析纯化步骤分离出纯度为90.7%的MOS-1。同时利用中温α-淀粉酶酶解法和重组毕赤酵母进行MOS-1的制备,将得到的贻贝寡糖分别进行称重,根据得到的贻贝寡糖质量与使用的贻贝多糖质量的比值计算贻贝寡糖得率。经计算,酶解法制备MOS-1,得率为0.59%;利用重组酵母制备MOS-1,得率为1.87%,是酶解法的3.17倍。与体外酶解工艺相比,利用重组酵母能够制备出高纯度、单组分的MOS-1,不仅可以满足药物申报要求,而且可以缩短时间、减少成本、提高产率。(2)MOS-1降血脂作用和机制的研究运用高脂饮食诱导法建立高脂血症小鼠模型,围绕血脂水平、脂类基因以及肠道菌群三方面对MOS-1的血脂调节作用进行探讨。在实验过程中,对小鼠的饮食、活动、毛发、体重等状态进行观察;测定给药前后小鼠血脂TG、TC、HDL-C和LDL-C水平;运用实时荧光定量PCR技术测定小鼠肝脏中相关脂质代谢基因 HL、LPL、FAS、ACC、CYP7A1、HMG-CoA reductase、LCAT、PPARα 的 mRNA水平;最后借助高通量测序对小鼠肠道菌群进行16S生物信息分析,主要包括OTU聚类、物种注释、α多样性分析以及β多样性分析。结果表明:经MOS-1灌胃干预后,与模型Ⅱ组相比,MOS-1干预组小鼠血清中TG、LDL-C水平显著降低(P<0.01);与模型Ⅱ组相比,MOS-1组小鼠肝脏中HL和PPARα转录水平显著上升(P<0.001),FAS转录水平显著下降(P<0.001),LPL、ACC 以及胆固醇代谢相关的 CYP7A1、HMG-CoA 和 LCAT转录水平无显著差异;MOS-1具有调节高血脂小鼠肠道菌群结构、丰富度和自由度的功能,MOS-1能显著减少致病菌Helicobacter的相对丰度,提高益生菌Allobaculum(P<0.001)的相对丰度,使高血脂小鼠肠道菌群趋向于正常状态。