研究背景:骨质疏松症（osteoporosis,OP）是一种以骨小梁减少、骨脆性增加为病理特征的代谢性骨病。流行病学资料已经证实,骨量丢失、骨密度下降是伴随年龄增长必然出现的自然过程,随之而来的则是发生骨折风险的增加。据估计,约有40%超过50岁的白人女性以及13%超过50岁的白人男性会发生骨质疏松性相关骨折。2005年,美国因骨质疏松相关性骨折一年的花费达到130亿至200亿美元,由于骨折的快速增长,预计至2025年,该花费将上升至250亿美元。随着老龄化社会的到来,骨质疏松及其相关性骨折,已成为一项引起广泛关注的重大的世界性健康问题。骨骼系统的完整性需要依靠骨吸收和骨形成的平衡来维持,而破骨细胞源于骨髓巨噬细胞,对骨平衡过程中的骨吸收有重要影响,了解破骨细胞的分化和活性,并针对性地给予干预,可以减少骨吸收,从而达到抗骨质疏松的目的。活性氧类（Reactive oxygen species,ROS）,是包含氧的一类小粒子,产生于正常的生物有氧代谢过程中。衰老、炎症反应等可增加ROS产生,而ROS的产生可能会进一步导致细胞及组织中的氧化强化物与抗氧化物之间的失衡导致氧化应激的产生。过去的几年里,人们发现,ROS引导的氧化应激随着年龄增长和炎症的环境和逐渐增加,会构成一个促进破骨的环境。越来越多的证据表明,ROS是调控破骨细胞分化的关键因子。各种抗氧化物都有可能减少ROS产生,尤其是各种天然抗氧化物,它们在减少ROS的同时,并不额外产新的副作用,所以具有抗氧化作用的各种植物都有良好的抗骨质疏松的潜能。重楼皂苷Ⅶ提取自百合科植物重楼,是一种皂苷化合物,也是一种天然抗氧化剂,具有减轻炎症反应,抗肿瘤和保护神经系统的作用。但其抑制骨质疏松症的相关研究,目前尚无相关报道。在本研究中,我们通过一系列体外实验来证实重楼皂苷Ⅶ对RANKL诱导的破骨细胞分化是否具有抑制作用并探究其机制。研究目的:1.建立健全RANKL+M-CSF诱导的BMM细胞向破骨细胞分化的模型2.利用破骨细胞分化模型,体外观察重楼皂苷Ⅶ对破骨细胞分化是否具有抑制作用。3.利用破骨细胞分化模型,对重楼皂苷Ⅶ抑制破骨细胞分化的分子机制进行初步探讨。4.构建骨质疏松动物模型,并体内观察重楼皂苷Ⅶ对骨质疏松的抑制作用。研究方法:1.分离培养BMM细胞,构建BMM向破骨细胞分化模型2.使用不同浓度重楼皂苷Ⅶ作用于BMM细胞,CCK-8检测细胞增殖情况,选择合适的重楼皂苷Ⅶ的使用浓度。结合前期建立的诱导破骨细胞分化模型,利用TRAP染色、TRAP酶活性测定,骨陷窝实验等观察重楼皂苷Ⅶ对破骨细胞分化是否具有抑制作用。使用不同浓度的重楼皂苷Ⅶ作用于诱导模型后,行荧光定量PCR检测,来观察重楼皂苷Ⅶ对破骨细胞分化过程中破骨细胞特异性表达的m RNA Tracp5b、Cts K、NFATc1的影响。3.结合RANKL诱导的破骨细胞分化模型,采用流式细胞仪、westem blot和免疫荧光,等方法观察重楼皂苷Ⅶ对RANKL诱导的破骨细胞分化过程中ROS变化的影响,以及对TRAF6-c Src-PI3K、MAPK和NF-κB等信号通路的作用情况。通过向BMM细胞转染pre-mi R-100-5p,确认pre-mi R-100-5p在破骨细胞分化过程中的作用,并探讨重楼皂苷Ⅶ与mi R-100-5p的关系。4.结合去卵巢大鼠构建的骨质疏松模型,采用Micro-CT来检测重楼皂苷Ⅶ对大鼠骨质结构的影响。结果:1.经实验证实,Raw264.7细胞向破骨细胞分化效率较低,结果较差。故而选用BMM细胞来构建破骨细胞分化模型,并成功构建BMM细胞向破骨细胞分化的细胞模型。2.经CCK-8检测,1u M到30u M浓度的重楼皂苷Ⅶ对BMM细胞没有明显毒性作用。3.TRAP染色、TRAP酶活性测定,骨陷窝实验等证实:相比于只加入诱导剂而未加入重楼皂苷Ⅶ的对照组,lu M到30u M浓度重楼皂苷Ⅶ能够显著抑制BMM细胞向破骨细胞的分化。经实时荧光定量PCR检测发现:lu M、10u M、30u M重楼皂苷Ⅶ都可以有效抑制破骨细胞分化过程中破骨细胞特异性基因Tracp5b、Cts K、NFATc1的表达,且抑制效果随重楼皂苷Ⅶ浓度增加而增强。4.流式细胞仪检测重楼皂苷Ⅶ对破骨细胞分化过程中ROS产生的作用。结果表明:RANKL可以增加ROS的产生,而重楼皂苷Ⅶ对RANKL诱导的ROS的产生有明显的抑制作用,且该抑制效果随重楼皂苷Ⅶ浓度增加而增强。5.Western blot检测重楼皂苷Ⅶ对破骨细胞分化过程中TRAF6-c Src-PI3K通路及Nox1蛋白表达的作用。结果表明:RANKL可以增加TRAF6和c Src的表达、提高PI3K的磷酸化并升高Nox1蛋白的表达,而重楼皂苷Ⅶ可以降低RANKL诱导的TRAF6和c Src的表达、抑制PI3K的磷酸化,并降低Nox1蛋白的表达6.Western blot检测重楼皂苷Ⅶ对破骨细胞分化过程中MAPK通路的作用。结果表明:RANKL可以增加MAPK通路中p38、ERK和JNK的磷酸化,而重楼皂苷Ⅶ对p38、ERK和JNK的磷酸化都有明显的抑制作用,且抑制效果随重楼皂苷Ⅶ浓度增加而增强。7.Western blot检测重楼皂苷Ⅶ对破骨细胞分化过程中NF-κB通路的作用。RANKL使IκB的磷酸化及降解明显增加,同时增加NF-κB的亚基p65的磷酸化。而重楼皂苷Ⅶ可明显抑制IκB的磷酸化及降解,以及p65的磷酸化。免疫荧光也显示:RANKL可以促进p65从细胞浆向细胞核内转移,而重楼皂苷Ⅶ可明显抑制该转移。8.RT-q PCR证实mi R-100-5p在破骨细胞分化过程中下调。对BMM细胞进行了pre-mi R-100-5p及其对照的转染,并发现转染后的BMM细胞经过诱导后破骨细胞特异性基因TRAP、Ctsk、及NFATc1的表达量明显下调,TRAP阳性的多核巨细胞也明显减少,这些都表明mi R-100-5p的过表达可以抑制破骨细胞分化。随后RT-q PCR证实重楼皂苷Ⅶ可以上调mi R-100-5p的表达,重楼皂苷Ⅶ也可能通过该途径来抑制破骨细胞分化。9.Micro-CT检测重楼皂苷Ⅶ在体内对骨质疏松的抑制作用。结果提示:与仅切除卵巢而未使用PP7的对照组相比,切除双侧卵巢同时使用PP7的大鼠的骨小梁厚度（Tb.Th）,骨体积分数（BV/TV）,骨密度（BMD）,骨小梁数（Tb.N）都明显升高,而骨小梁分离度（Tb.Sp）则出现显著降低。Micro-CT的三维重建图像也显示,与去卵巢大鼠相比,去卵巢+PP7组大鼠的骨小梁数量有明显增加,粗大,间距更加致密,且断裂减少,上述结果都表明PP7对于骨质疏松有治疗作用。结论:1.成功建立RANKL诱导的BMM细胞向破骨细胞分化模型,为后续观察重楼皂苷Ⅶ对破骨细胞分化的作用及相关机制研究打下了良好的实验基础。2.重楼皂苷Ⅶ在体外可以明显抑制破骨细胞分化3.重楼皂苷Ⅶ对破骨细胞分化的抑制作用与其抗氧化并减少ROS产生,并对TRAF6-c Src-PI3K、MAPK和NF-κB信号通路的抑制作用相关。mir-100-5p可以抑制破骨细胞分化,重楼皂苷Ⅶ对破骨细胞分化的抑制作用也与其上调mir-100-5p的作用相关。4.重楼皂苷Ⅶ在动物体内也可以明显抑制骨质疏松