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一、研究背景和目的大肠杆菌 O157:H7(Enterohaemorrhagic E.coli O157:H7,EHEC O157:H7 O157:H7)是一种高度传染性的食源性病原体,可引起严重的胃肠道疾病,对人类健康造成潜在的严重威胁。目前对EHEC O157:H7感染缺乏有效的治疗方案,抗生素治疗并没有改善EHEC O157:H7引起的肠炎病程,甚至会增加并发肾溶血性尿毒综合症(Hemolytic-uremic syndrome,HUS)的危险。因此,目前亟需转变策略,发展以预防为主的防控手段,以减少EHEC O157:H7感染带来的疾病和经济负担。鼠李糖乳杆菌GG株(Lactobacillus rhamnosus GG,LGG)活菌本身及其代谢物都是目前研究得最为深入的益生菌。我们先前的研究表明LGG培养上清液(LGG culture supernatant,LCS)可促进新生大鼠肠道屏障功能的发育和完善,并增强其对大肠杆菌K1株感染的抵抗力;利用高效液相色谱-串联质谱分析技术,我们鉴定出LCS中潜在的生物活性蛋白(命名为HM0539),并发现其对肠屏障功能有益。但是HM0539是否对EHEC O157:H7的感染具有预防及治疗作用还未可知。本研究主要通过体内、外实验考察HM0539防治EHEC O157:H7感染的效果,并探讨在此过程中HM0539对EHEC O157:H7感染肠道上皮屏障功能的影响及其潜在机制。二、研究方法1、将HT-29细胞培养于24孔板中,置于37℃,5%二氧化碳恒温箱中培养10天;然后根据HM0539不同浓度(10 ng/mL和100 ng/mL)实验分组及HM0539不同处理方式(预处理和共同处理)实验分组,加入1×107 CFU EHEC O157:H7处理4h进行黏附侵袭实验;EHEC O157:H7相对黏附/侵袭率=(处理组各组菌落数/对照组中菌落数的均数)×100%。2、HT-29细胞培养、分组及处理同上;通过PAS蛋白浓度定量法检测各组细胞的Mucin表达量,细胞免疫荧光实验及Western blot技术比较各组细胞MUC2、ZO-1和Occludin蛋白的表达情况。3、将小鼠随机分成4组(攻毒前,NC组和EHEC O157:H7组每天灌胃空白果胶,连续7d;HM0539组和HM0539+EHEC O157:H7组每天灌胃HM0539果胶,连续7d),10只/组。攻毒前提前3d用链霉素水喂食小鼠并禁食12h,EHEC O157:H7 组和 HM0539+EHEC O157:H7 组用 100μL×1011CFU/mL EHEC O157:H7菌液灌胃小鼠,同时腹腔注射丝裂霉素(2.5mg/kg),间隔12h后用同样的菌量再次灌胃小鼠。NC组和HM0539组用100μL无菌PBS模拟攻毒。观察小鼠感染状态一周,记录小鼠的体重及存活情况,通过HE染色、PAS染色及免疫组化技术检测小鼠肠道损伤情况。4、HT-29细胞和Caco-2细胞的培养、分组及处理同上,通过ELISA比较各组细胞培养上清液IL-1β的表达情况,Western blot技术比较各组细胞TLR4/NF-κB通路的激活情况;小鼠的分组及处理同上,提取肠组织总蛋白,通过ELISA比较各组小鼠肠组织IL-1β的表达情况,Western blot 比较各组小鼠肠组织TLR4/NF-κB通路的激活情况。5、使用软件SPSS20.0分析统计数据,采用GraphPad Prisn5.0制作图表。t检验用于两组间比较,单因素方差(one-way ANOVA)用于多组间比较,用均数士标准差(Mean+SD)的形式表示计量资料数据,所有实验均重复3次,P<0.05被认为差异具有统计学意义。二、研究结果1、体外实验探讨HM0539对EHEC O157:H7黏附、侵袭HT-29细胞的作用,我们发现HM0539可以抑制EHEC O157:H7黏附、侵袭HT-29细胞,且具有浓度依赖性(P<0.05);另一方面也发现HM0539预处理的效果优于HM0539与EHEC O157:H7共同处理的效果(P<0.05)。2、体内实验显示HM0539降低了攻毒小鼠的死亡率并抑制了体重下降(P<0.05),运用HE染色法对小鼠肠道染色发现,EHEC O157:H7能够诱导空肠绒毛萎缩和隐窝脓肿,而HM0539能够扭转上述肠道病变。3、运用PAS染色法对HT-29细胞及小鼠肠道染色发现,EHEC 0157:H7能够降解粘蛋白(Mucin),HM0539可以抑制EHEC O157:H7对Mucin的降解(P<0.05)。4、肠道屏障功能检测显示HM0539可以抑制EHEC O157:H7对紧密连接蛋白的破坏(P<0.05),从而保护肠道屏障的完整性。5、体内外实验发现EHEC O157:H7组分泌较高的IL-1β并激活TLR4/NF-κB信号通路,而HM0539改变了上述情况(P<0.05)。三、结论1、预防性使用HM0539比HM0539与EHEC O157:H7同时处理的效果好,本文主要研究预防性使用HM0539防治EHEC O157:H7肠道感染的效果。2、HM0539可以抑制EHEC O157:H7降解肠上皮细胞的黏蛋白、破坏细胞间紧密连接,从而保护肠道屏障的完整性。3、HM0539可能通过抑制EHEC O157:H7激活TLR4/NF-κB信号通路和下调IL-1β的分泌,从而减轻EHEC O157:H7诱导的炎症反应。