论文部分内容阅读
奶牛子宫内膜炎始终是奶牛产后主要疾病之一,严重影响奶牛受孕率,降低经济效益。该病主要由产后细菌感染所致,其致病细菌种类繁多,难以防控。近年来抗生素的应用更是导致细菌耐药性的增强,进一步增大了该病的防治难度。针对以上现状,本研究对陕西关中宝鸡、西安、渭南、杨陵地区的4个奶牛场进行调查和样品采集,对采集样品进行致病菌的分离鉴定及药物敏感性试验,并建立主要致病菌的多重PCR检测方法。取得如下结果:1.对陕西关中地区4个奶牛场的74头患病奶牛进行子宫脓液样品的采集。并从66份有效样品中分离到13种细菌,共计113株,分别为大肠埃希菌38株、化脓隐秘杆菌29株、链球菌19株（乳房链球菌13株、停乳链球菌3株和多动物链球菌3株）、葡萄球菌11株（金黄色葡萄球菌1株、松鼠葡萄球菌4株、木糖葡萄球菌3株和溶血性葡萄球菌3株）、芽胞杆菌6株、绿色气球菌5株、奇异变形杆菌4株和绿脓杆菌1株。2.对分离到的细菌使用昆明小鼠进行动物致病性试验,结果表明分离到的细菌中大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌和化脓隐秘杆菌致病性较强,乳房链球菌和停乳链球菌其次,其他细菌致病性都较弱。3.对分离到的细菌进行药敏试验,结果表明分离到的细菌对头孢他啶、青霉素G、氨苄西林、卡那霉素和克林霉素耐药性较为严重,头孢喹肟、哌拉西林和阿莫西林/棒酸抗菌效果良好。4.建立了一种能同时快速检测6种致病菌的多重PCR检测方法。根据致病性大肠埃希菌的ycjM基因、化脓隐秘杆菌的plo基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因、乳房链球菌的pauA基因、绿脓杆菌的O抗原乙酰基转移酶基因和奇异变形杆菌的尿素酶合成的正向调节因子R基因来设计特异性引物,其扩增产物条带大小依次为548 bp、338 bp、424 bp、1135 bp、708 bp、951 bp。结果表明其最佳反应体系为:反应引物5.6μL（其中大肠埃希菌0.75μL,化脓隐秘杆菌0.7μL,金黄色葡萄球菌0.5μL,乳房链球菌1.5μL,绿脓杆菌0.95μL,奇异变形杆菌1.2μL）,ddH2O 3.9μL,r Taq（RR901A）12.5μL,反应总体系25μL。反应最佳退火温度为58℃,循环次数为30次。5.对建立的多重PCR检测方法进行模板敏感度测试,结果表明其最低敏感度分别为大肠埃希菌40 pg/μL,化脓隐秘杆菌40 pg/μL,金黄色葡萄球菌40 pg/μL,乳房链球菌4 pg/μL,绿脓杆菌4 pg/μL,奇异变形杆菌4 pg/μL。对临床采集样品进行检测,其检测结果良好。