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不分节段负链RNA病毒基因组3’和5’末端非编码区分别为leader和trailer序列,leader和trailer部分碱基可互补配对形成锅柄状二级结构,该区域包含病毒基因组复制和mRNA转录起始所必需的顺式作用元件。随着动物负义RNA病毒的反向遗传学体系的建立,研究人员对动物负义RNA病毒的末端顺式作用元件进行了一系列的研究,发现了病毒转录与复制的关键调控序列,也揭示了相关的二级结构在病毒转录与复制中的作用。然而由于缺乏可用的反向遗传学体系,人们对侵染植物的负义RNA病毒的末端顺式作用元件的功能所知甚少。苦苣菜黄网病毒(Sonchus yellow net virus, SYNV)属于弹状病毒科(Rhabdoviridae),细胞核弹状病毒属(Nucleorhabdovirus),是侵染植物的不分段的负义RNA病毒,其leader与trailer序列也能部分互补配对,形成茎环状二级结构。本研究利用实验室前期构建的表达eGFP和DsRed报告基因的SYNV微型复制子(Minireplicon, MR)系统,对SYNV基因组末端leader和trailer的部分序列进行了一系列的缺失、置换、颠换等突变分析,初步探索了其在病毒mRNA转录中的作用。首先,通过快速扩增cDNA末端(Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)分析,明确了SYNV微型复制子末端leader和trailer的序列与NCBI数据库中SYNV病毒的末端序列一致。结构预测发现leader和trailer前30 nt形成的二级结构中,1-17 nt配对程度高,形成茎(stem)结构,leader上第18-21 nt、第28 nt分别形成四碱基凸起(bulge 1)和单碱基凸起(bulge2)。1.茎(stem)的突变分析对1-17 nt预测形成的stem进行缺失突变分析发现,leader缺失末端3nt、6nt或10 nt, SYNV-MR报告基因转录水平都显著降低,且其下降的程度与缺失的碱基数目直接相关；相似地,trailer缺失3nt、5 nt、10 nt后报告基因转录水平显著降低,且下降程度一致。进一步在trailer区打开stem结构配对,随着打开碱基对的增加,SYNV-MR报告基因转录水平依次下降；但将stem结构中leader和trailer区序列进行不同程度的互换,SYNV-MR报告基因几乎不表达。这些结果能够说明leader 3’末端序列包含病毒转录的启动子序列,trailer可能通过与leader互补配对参与病毒的转录过程。2. bulgel的突变分析针对四碱基凸起bulge 1的UUUA做了一系列的突变分析,发现缺失UUUA, SYNV-MR报告基因不表达；在trailer上增加AAAU使之互补后,SYNV-MR报告基因表达水平下降近一半,这说明bulgel凸起结构和凸起上的碱基序列对病毒转录起重要作用。接着变换4个碱基序列发现,碱基都为A/U时,不影响病毒转录。而碱基都为C/G时,病毒转录水平严重下降。有趣的是,保持中间2个碱基为GG或CC,两边2个碱基为A/U,病毒转录也几乎不受影响。而保持3个碱基顺序不变,一次只将首尾一个碱基变为G/C,发现只有突变体UUUG转录水平较野生型UUUA有所下降。同时发现,4个碱基中G/C比例高或G/C位于两边,都会下调报告基因mRNA的转录水平。3. bulge2的突变分析对leader上第28位碱基U (bulge2)进行突变分析发现,该碱基在病毒转录过程中起重要作用。将其缺失后,SYNV-MR报告基因只有微弱的表达；将其调换到相应的trailer区,报告基因几乎不表达。而在trailer区增加碱基A使其互补配对后,SYNV-MR转录水平也会下调。将U进行置换发现,U变为A或G是对病毒转录无影响,而变为C时病毒转录水平下调近50%。这表明,bulge2的U对病毒转录很重要,碱基C下调病毒转录水平,同时这个凸出的环可能有利于病毒RNA聚合酶的识别。综上所述,SYNV leader和trailer前10 nt在病毒mRNA转录过程中发挥重要作用,trailer可能通过与leader互补配对参与病毒mRNA转录过程；二者所形成的环状凸起bulge,可能有利于病毒RNA聚合酶的识别。