目的基于针灸“治未病”思想,本研究首先通过比较不同时长水浸束缚应激（Water-immersion restraint stress,WRS）对大鼠胃黏膜形态结构和功能的影响,筛选早期应激性胃黏膜损伤（Stress-induced gastric mucosal lesions,SGML）大鼠模型。随后观察足三里电针预处理对早期SGML大鼠胃黏膜形态结构和功能的影响及对穴区肥大细胞（Mast cells,MCs）分布、数目和脱颗粒的影响,并分析足三里电针预处理对早期SGML大鼠胃黏膜的影响与穴区肥大细胞相关性。进一步,以穴区肥大细胞为切入点,于大鼠双侧足三里穴位注射肥大细胞膜稳定剂色苷酸钠（Sodium cromoglicate,SCG）,观察穴位注射肥大细胞膜稳定剂SCG对足三里电针预处理发挥胃黏膜保护效应的影响。在此基础上,提取足三里电针预处理大鼠针刺血清体外培养大鼠正常胃黏膜上皮细胞系RGM1,并与穴位注射SCG的大鼠针刺血清对照,观察不同来源的大鼠针刺血清对胃黏膜上皮细胞系RGM1功能的影响。综合分析体内、外实验结果,探讨足三里电针预处理对早期SGML大鼠发挥胃黏膜保护效应及机制,为临床电针预防早期SGML相关病症提供实验依据。方法40只SD雄性大鼠遵照随机数字表法分为4组:（1）正常对照组（WRS 0min组）,（2）水浸束缚应激10min组（WRS 10min组）,（3）水浸束缚应激30min组（WRS 30min组）,（4）水浸束缚应激60min组（WRS60min组）,每组10只。各组大鼠在相应时长水浸束缚应激结束后立即从水中取出,行心脏灌注固定。测量大鼠胃液p H值;肉眼观察胃黏膜大体损伤情况并统计黏膜损伤指数（Damage index,DI）;苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色光镜下观察大鼠胃黏膜形态结构并统计病理组织学评分;过碘酸雪夫染色（Periodic acid-schiff stain,PAS）染色后光镜下观察大鼠胃黏膜黏液量并对黏液量进行半定量。48只SD大鼠遵照随机数字表法分为4组:（1）正常对照组（Control组）:除连续7天给予与EA组相同的抓取和固定外,不做其他任何处理,n=12;（2）水浸束缚应激10min造模组（WRS组）:连续7天予以与EA组大鼠同样方式的抓取和固定,第8天予以水浸束缚应激造模,n=12;（3）电针预处理+水浸束缚应激造模组（EA+WRS组）:先连续7天予以双侧足三里电针预处理,末次电针预处理结束后24h行水浸束缚应激10min造模,n=12;（4）单纯电针预处理组（EA组）:除予以连续7天的双侧足三里电针预处理外,不做其他任何处理,末次电针预处理结束后24h直接取材,n=12。每组中随机挑选6只大鼠用于心脏灌注固定,取胃组织和足三里穴区组织继续后固定;剩余6只大鼠用于新鲜组织刮取胃黏膜和取穴区皮肤及皮下组织。首先,肉眼观察胃黏膜损伤的大体情况并统计胃黏膜DI;HE染色后光镜下观察大鼠胃黏膜病理组织学改变并统计病理组织学评分;PAS染色后光镜下观察大鼠胃黏膜黏液量;甲苯胺蓝染色观察胃黏膜组织MCs的分布、数目及形态,并统计MCs数目及脱颗粒率;免疫组织化学染色后光镜下观察胃黏膜肥大细胞-类胰蛋白阳性细胞的分布与数目,并统计阳性细胞率;酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测胃黏膜组织炎性因子IL-33、TNF-α、IL-6、IL-17的水平及5-HT、HA的含量;Western blot检测胃黏膜组织NF-κB信号通路相关蛋白p-IκBα（Ser32）,IκBα,pNF-κB（Ser468）,NF-κB表达水平。随后,甲苯胺蓝染色观察足三里穴区组织MCs的分布、数目及形态,并统计MCs数目及脱颗粒率;ELISA检测足三里穴区组织中5-HT、HA的含量。最后,Pearson相关系数分析足三里穴区MCs脱颗粒率与胃黏膜损伤指数DI、胃黏膜病理组织学评分、胃黏膜黏液量之间的相关性。48只SD大鼠遵照随机数字表法随机分为2组,一组予以双侧足三里穴位注射生理盐水（Normal saline,NS）;另一组给予双侧穴位注射肥大细胞膜稳定剂色苷酸钠（SCG）;两组又分别包含水浸束缚应激造模组和电针预处理+应激造模组两个亚组,总共有4个亚组:（1）NS+WRS组:第1～7天,每天于大鼠双侧足三里穴位各注射NS 10μl,第8天行水浸束缚应激10min造模,n=12;（2）NS+EA+WRS组:第1～7天,每天先于大鼠双侧足三里穴位各注射NS 10μl,半小时后行双侧足三里电针预处理,第8天行水浸束缚应激10min造模,n=12;（3）SCG+WRS组:第1～7天,每天于大鼠双侧足三里穴位各注射SCG 10μl,第8天行水浸束缚应激10min造模,n=12;（4）SCG+EA+WRS组:第1～7天,每天先于大鼠双侧足三里穴位各注射SCG 10μl,半小时后行双侧足三里电针预处理,第8天行水浸束缚应激10min造模,n=12。每组随机挑选6只大鼠用于心脏灌注固定,取足三里穴区组织和胃组织继续后固定;剩余6只大鼠用于新鲜组织刮取胃黏膜。甲苯胺蓝染色观察足三里穴区组织及胃黏膜组织MCs分布、数目及形态,并统计MCs数目及脱颗粒率;肉眼观察胃黏膜损伤的大体情况并统计胃黏膜DI;HE染色后光镜下观察大鼠胃黏膜病理组织学改变并统计病理组织学评分;PAS染色后光镜下观察大鼠胃黏膜黏液量;ELISA检测胃黏膜炎性因子IL-33、IL-6、IL-17、TNF-α的水平及5-HT、HA的含量。40只SD大鼠遵照随机数字表法随机分为4组,每组10只:（1）NS+Control组:于大鼠双侧足三里穴位注射生理盐水各10μl,每天一次,连续7天;（2）NS+EA组:先于大鼠双侧足三里穴位注射生理盐水各10μl,半小时后行双侧足三里电针预处理,每天一次,连续7天;（3）SCG+Control组:于大鼠双侧足三里穴位注射SCG各10μl,每天一次,连续7天;（4）SCG+EA组:先于大鼠双侧足三里穴位注射SCG各10μl,半小时后行双侧足三里电针预处理,每天一次,连续7天。各组大鼠在相应处理结束后24h,心尖采血,提取血清,采用220nm过滤膜过滤除菌,56℃灭活备用。体外培养大鼠正常胃黏膜上皮细胞系RGM1,并采用提取的大鼠血清体外培养RGM1。RGM1细胞根据接受不同组别来源的大鼠血清分为4组:（1）NS+C+R组:NS+Control组大鼠血清培养的RGM1;（2）NS+EA+R组:NS+EA组大鼠针刺血清培养的RGM1;（3）SCG+C+R组:SCG+Control组大鼠血清培养的RGM1;（4）SCG+EA+R组:SCG+EA组大鼠针刺血清培养的RGM1。MTT比色法筛选大鼠血清体外培养RGM1的最适浓度;台盼蓝染色计算RGM1细胞存活率;PAS染色观察RGM1黏液分泌能力;ELISA检测RGM1上清炎性因子IL-33、TNF-α、IL-6的水平;Western blot检测RGM1细胞蛋白p-IκBα（Ser32）,IκBα,p-NF-κB（Ser468）,NF-κB的表达水平。结果1不同时长水浸束缚应激对大鼠胃粘膜形态结构与功能的影响（1）胃黏膜大体观:与WRS 0min组相比,其余各组大鼠胃黏膜均出现不同程度的损伤,轻则胃黏膜水肿、表面有散在的点状出血点,重则胃黏膜出现条索状出血、糜烂甚至溃疡;统计分析结果显示,随着水浸束缚应激时长增加,胃黏膜损伤指数DI明显增大（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05）。（2）胃液p H值:四组之间大鼠胃液p H的差异具有统计学意义。与WRS 0min组相比,WRS 10min组大鼠胃液p H值未发生明显变化;与WRS 0min及WRS 10min组分别相比,WRS 30min组大鼠胃液p H值明显降低（P＜0.01,P＜0.01）;与WRS 10min及WRS 30min组分别相比,WRS 60min组大鼠胃液p H值明显降低（P＜0.01,P＜0.05）。（3）胃黏膜病理组织学改变:WRS 0min组大鼠胃黏膜未见明显病理改变。WRS 10min组大鼠胃黏膜上皮不完整、出现断裂,上皮细胞肿胀变性;黏膜固有层腺体稀疏、排列较紊乱;黏膜下层小血管清晰可见,血管扩张及淤血,内有红细胞渗出;黏膜局部有炎症性细胞浸润。WRS 30min组大鼠胃黏膜上皮出现脱落、厚度降低,上皮细胞变性增多;腺体稀疏及排列紊乱加重;黏膜下层明显充血、水肿,血管内有明显红细胞渗出,黏膜局部炎性细胞浸润加重。WRS 60min组大鼠胃黏膜上皮明显脱落,黏膜坏死;固有层腺体明显萎缩、数目减少;黏膜下层充血、水肿加剧,血管内红细胞渗出加重,黏膜有大量炎性细胞浸润,损伤深及肌层。与WRS 0min组相比,其余三组大鼠胃黏膜病理组织学评分均明显增大（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01）,且随着水浸束缚应激时长的增加,病理组织学评分越大（P＜0.05,P＜0.01）。（4）胃黏膜黏液量的变化:WRS 0min组大鼠胃黏膜上皮覆盖有一层厚厚的、连续的黏液,被PAS染液染成一簇簇紫红色条带;表面黏液细胞数量充足、结构完整、排列紧密,胞质位于顶部,充满黏原颗粒。WRS 10min组大鼠胃黏膜上皮不完整,偶见断裂;表面黏液细胞肿胀变性;黏膜黏液量减少。WRS 30min组大鼠胃黏膜上皮不完整,多处可见黏膜缺口;表面黏液细胞发生变性、数目减少、排列稀疏;黏膜黏液量明显减少。WRS 60min组大鼠胃黏膜上皮大块脱落,表面黏液细胞缺失,黏液层消失。与WRS 0min相比,其余三组大鼠胃黏膜黏液量均明显减少（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01）;且,随着水浸束缚应激的时间延长,胃黏膜黏液量减少地越多（P＜0.01,P＜0.05）。2足三里电针预处理对早期SGML大鼠胃黏膜形态结构和功能的影响（1）胃黏膜大体观:Control组大鼠胃黏膜光滑,色泽红润,未见明显出血点及糜烂,其余三组大鼠胃黏膜均出现不同程度的水肿、出血、糜烂。与Control组相比,WRS组大鼠胃黏膜DI明显增大（P＜0.01）;与WRS组相比,EA+WRS组大鼠胃黏膜DI明显减小（P＜0.01）。（2）胃黏膜病理组织学改变:Control组和EA组大鼠胃黏膜形态结构完好,层次清晰,黏膜各层未见明显病理组织学改变。WRS组与EA+WSR组大鼠胃黏膜上皮不完整、出现断裂,胃黏膜腺体有不同程度的萎缩及排列紊乱,黏膜下层小血管清晰可见,血管内有不同程度的红细胞渗出,黏膜有不同程度炎性细胞浸润。与Control组相比,WRS组大鼠胃黏膜病理组织学评分明显升高（P＜0.01）;与WRS组相比,EA+WRS组大鼠胃黏膜病理组织学评分明显降低（P＜0.05）。（3）胃黏膜黏液量的变化:与Control组相比,WRS组大鼠胃黏膜黏液量明显减少（P＜0.01）;与WRS组相比,EA+WRS组大鼠胃黏膜黏液量明显增多（P＜0.05）。（4）胃黏膜MCs数目及脱颗粒率的变化:与Control组相比,WRS组大鼠胃黏膜MCs数目及脱颗粒率明显增加（P＜0.01,P＜0.01）;与WRS组相比,EA+WRS组大鼠胃黏膜MCs数目及脱颗粒率明显降低（P＜0.01,P＜0.01）。免疫组织化学染色结果显示,与Control组相比,WRS组大鼠胃黏膜Mast Cell-Tryptase阳性细胞率明显增加（P＜0.01）;与WRS组相比,EA+WRS组大鼠胃黏膜Mast Cell-Tryptase阳性细胞率明显减少（P＜0.05）。ELISA检测结果显示,与Control组相比,WRS组大鼠胃黏膜组织5-HT、HA的含量均明显升高（P＜0.05,P＜0.05）;与WRS组相比,EA+WRS组胃黏膜组织5-HT、HA的含量均明显减少（P＜0.01,P＜0.01）。（5）胃黏膜炎性因子水平的变化:与Control组相比,WRS组大鼠胃黏膜组织IL-33、TNF-α、IL-6、IL-17的含量均明显升高（P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01）。与WRS组相比,EA+WRS组大鼠胃黏膜IL-33、TNF-α、IL-6、IL-17的含量均明显降低（P＜0.05,P＜0.05,P＜0.05,P＜0.01）。（6）胃黏膜组织NF-κB信号通路相关蛋白表达的变化:与Control组相比,WRS组胞浆蛋白p-IκBα（Ser32）/IKBα的值显著升高,差异具有统计学意义（P＜0.01）;胞浆蛋白NF-κB的表达明显降低,差异具有统计学意义（P＜0.01）;胞核蛋白p-NF-κB（Ser468）的表达明显升高,差异具有统计学意义（P＜0.01）。与WRS组相比,EA+WRS组胞浆蛋白pIκBα（Ser32）/IKBα的值显著降低,差异具有统计学意义（P＜0.01）;胞浆蛋白NF-κB的表达明显升高,差异具有统计学意义（P＜0.01）;胞核蛋白p-NF-κB（Ser468）的表达明显降低,差异具有统计学意义（P＜0.01）。3足三里电针预处理对早期SGML大鼠胃黏膜保护作用与穴区肥大细胞相关性（1）足三里穴区组织MCs数目及脱颗粒的变化:与Control组相比,EA组大鼠足三里穴区MCs数目及脱颗粒率明显增加（P＜0.01,P＜0.05）;5-HT和HA的含量也均明显增加（P＜0.01,P＜0.01）。与WRS组相比,EA+WRS组大鼠足三里穴区MCs数目及脱颗粒率亦明显升高（P＜0.05,P＜0.01）;5-HT和HA的含量也均明显增加（P＜0.01,P＜0.01）。（2）相关性分析:Pearson相关系数分析结果显示,MCs脱颗粒率与胃黏膜损伤指数DI之间呈线性负相关,相关性系数为r=-0.9063,（P＜0.0001）;MCs脱颗粒率与胃黏膜病理组织学评分之间呈线性负相关,相关性系数为r=-0.8765,（P＜0.0001）;MCs脱颗粒率与胃黏膜黏液量之间呈线性正相关,相关性系数为r=0.9017,（P＜0.0001）。4穴位注射肥大细胞膜稳定剂对足三里电针预处理发挥胃黏膜保护效应的影响（1）穴区MCs数目及脱颗粒情况:与NS+WRS组相比,SCG+WRS组大鼠足三里穴区MCs数目及脱颗粒率均明显减少（P＜0.05,P＜0.01）;与NS+EA+WRS组相比,SCG+EA+WRS组大鼠足三里穴区MCs数目及脱颗粒率亦明显减少（P＜0.01,P＜0.01）。（2）胃黏膜大体观:NS+EA+WRS组大鼠胃黏膜表面光滑,仅有少量出血点,损伤较轻;其余三组大鼠胃黏膜出血点较多,呈点状或条状或团块状,损伤较重。与NS+WRS组相比,NS+EA+WRS组大鼠胃黏膜DI明显减小（P＜0.01）;与NS+EA+WRS组相比,SCG+EA+WRS组大鼠胃黏膜DI明显升高（P＜0.01）。（3）胃黏膜病理组织学改变:NS+EA+WRS组大鼠胃黏膜形态结构较为完整,黏膜上皮较连续,偶见少量上皮细胞变性、坏死;黏膜固有层腺体排列较规则,黏膜下层轻度水肿,黏膜下血管内可见少量红细胞渗出,黏膜散在炎性细胞浸润;其余三组大鼠均出现较NS+EA+WRS组更严重的组织形态损伤。与NS+WRS组相比,NS+EA+WRS组大鼠胃黏膜病理组织学评分明显降低（P＜0.01）;与NS+EA+WRS组相比,SCG+EA+WRS组大鼠胃黏膜病理组织学评分明显升高（P＜0.01）。（4）胃黏膜黏液量的改变:NS+EA+WRS组大鼠胃黏膜上皮偶见断裂,黏膜上皮覆盖的黏液层被PAS染液染成紫红色,其余三组大鼠胃黏膜黏液均出现不同程度的减少。与NS+WRS组相比,NS+EA+WRS组大鼠胃黏膜黏液量明显增多（P＜0.05）;与NS+EA+WRS组相比,SCG+EA+WRS组大鼠胃黏膜黏液量明显减少（P＜0.01）。（5）胃黏膜MCs数目及脱颗粒的变化:与NS+WRS组相比,NS+EA+WRS组大鼠胃黏膜MCs数目、脱颗粒率及5-HT、HA的含量均明显增加（P＜0.01,P＜0.01;P＜0.01;P＜0.05）;与NS+EA+WRS组相比,SCG+EA+WRS组大鼠胃黏膜MCs数目及HA含量明显降低（P＜0.05;P＜0.05）,MCs脱颗粒率与5-HT含量在二者之间无明显差异。（6）胃黏膜组织炎性因子水平的变化:与NS+WRS组相比,NS+EA+WRS组大鼠胃黏膜组织IL-33、TNF-α、IL-6、IL-17的含量均明显降低（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01）;与NS+EA+WRS组相比,SCG+EA+WRS组大鼠胃黏膜组织IL-33、TNF-α、IL-6含量均明显升高（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.05）,但IL-17的含量在二者无明显差异。与SCG+WRS组相比,SCG+EA+WRS组大鼠胃黏膜组织IL-17的含量明显降低（P＜0.05）,但IL-33、TNF-α、IL-6的含量在二者胃黏膜组织中均无明显差异。5针刺血清对胃黏膜上皮细胞RGM1功能的影响（1）MTT比色法筛选针刺血清体外培养RGM1的最适浓度:MTT检测结果显示,浓度为20%的大鼠针刺血清对RGM1细胞增殖的影响最大,其OD值为1.555±0.03,其他浓度干预下的OD值均较之明显减小（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01）。（2）RGM1细胞存活率:台盼蓝染色后计算RGM1细胞存活率,单因素方差分析结果显示,四组之间RGM1细胞存活率无明显差异（F=0.3779,P=0.7699）。（3）RGM1黏液的分泌:NS+EA+R组RGM1细胞染色较深,胞核呈蓝色,胞质被染成深红色,细胞膜外包围着厚厚的红色染色物,细胞间隙不清晰,可见绛红色团块;其余三组细胞之间染色差异不大,均较NS+EA+R组浅,胞核呈蓝色,胞质呈淡红色或粉红色,细胞周围包围着淡淡的红色染色物,细胞间间隙清晰。与NS+C+R组相比,NS+EA+R组细胞黏液分泌明显增多（P＜0.05）;与NS+EA+R组相比,SCG+EA+R组细胞黏液分泌明显减少（P＜0.05）。（4）RGM1炎性因子的释放:与NS+C+R组相比,NS+EA+R组细胞培养上清IL-33、IL-6含量明显减少（P＜0.05,P＜0.05）;与NS+EA+R组相比,SCG+EA+R组细胞培养上清IL-33、IL-6含量明显增加（P＜0.05,P＜0.05）;而TNF-α含量在四组之间无明显差异。（5）RGM1细胞NF-κB信号通路相关蛋白的表达:与NS+C+R组相比,NS+EA+R组RGM1胞浆蛋白p-IκBα（Ser32）/IκBa的值显著减小,差异具有统计学意义（P＜0.01）;胞浆蛋白NF-κB的表达显著升高,差异具有统计学意义（P＜0.01）;同时,胞核蛋白p-NF-κB（Ser468）的表达明显降低,差异具有统计学意义（P＜0.01）。与NS+EA+R组相比,SCG+EA+R组RGM1胞浆蛋白p-IκBα（Ser32）/IκBa的值显著增大,差异具有统计学意义（P＜0.01）;胞浆蛋白NF-κB的表达明显降低,差异具有统计学意义（P＜0.01）;同时,胞核蛋白p-NF-κB（Ser468）的表达明显升高,差异具有统计学意义（P＜0.01）。结论（1）10min的水浸束缚应激可成功诱导病位浅、病势轻的早期SGML大鼠模型。（2）足三里电针预处理可减轻早期SGML大鼠胃黏膜形态结构的损伤,增加胃黏膜黏液量,减少胃黏膜MCs数目及脱颗粒,抑制胃黏膜NF-κB信号通路的激活,降低胃黏膜炎性因子IL-33、TNF-α、IL-6、IL-17的释放,对早期SGML大鼠发挥胃黏膜保护作用。（3）足三里电针预处理可增加穴区MCs数目及脱颗粒;且足三里穴区MCs脱颗粒率与胃黏膜DI及胃黏膜病理组织学评分之间呈线性负相关,与胃黏膜黏液量呈线性正相关。这提示足三里电针预处理对早期SGML大鼠发挥的胃黏膜保护作用,与电针预处理激活穴区肥大细胞的功能有关。（4）足三里穴位注射肥大细胞膜稳定剂SCG,可抑制电针预处理引起的穴区MCs聚集及脱颗粒,减少电针预处理引起的胃黏膜黏液的增加,削弱电针预处理对早期SGML大鼠胃黏膜MCs聚集的抑制作用,增加胃黏膜炎性因子的释放,从而削弱足三里电针预处理对早期SGML大鼠发挥的胃黏膜保护作用。提示穴区肥大细胞脱颗粒参与了足三里电针预处理对早期SGML大鼠发挥的胃黏膜保护作用。（5）足三里电针预处理大鼠的针刺血清可增加胃黏膜上皮细胞RGM1黏液的分泌、抑制RGM1细胞NF-κB信号通路的激活、减少RGM1炎性因子的释放,从而发挥胃黏膜上皮细胞保护效应;且针刺血清对RGM1的这种保护效应可因穴位注射肥大细胞膜稳定剂SCG后减弱。（6）综合以上体内、外实验结果,本研究发现足三里电针预处理可通过诱导大鼠足三里穴区肥大细胞聚集和脱颗粒,产生成分复杂的生物活性物质入血,随着体液途径输送到胃组织,直接作用于胃黏膜上皮细胞,促进胃黏膜上皮细胞黏液的释放,抑制胃黏膜上皮细胞NF-κB信号通路的激活,减轻胃黏膜炎性因子的释放,从而对早期SGML大鼠发挥胃黏膜保护作用。