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目的:糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy,DR)是严重的致盲性眼病,其确切发病机制尚不完全清楚。近年来的研究发现许多细胞因子在DR的发病过程中起到了很重要的作用,其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)因具有促进内皮细胞迁移、增殖和血管形成,提高血管通透性等多种生物学效应而在DR的各种病理改变中占有重要地位。作为拮抗性的内源性血管生成抑制因子,色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)具有强烈的抗血管生成作用和神经元细胞保护及营养作用。当增加视网膜PEDF蛋白水平时可以明显抑制低氧诱导模型的视网膜新生血管形成和STZ诱导糖尿病模型的血-视网膜屏障的破裂。以VEGF为代表的促血管生成因子和以PEDF为代表的抑制血管生成因子间的动态平衡是维持正常视网膜血管系统的首要因素,而在糖尿病时这种平衡的破坏导致了血管的渗漏和新生血管的发生。因而揭示VEGF、PEDF在糖尿病过程中视网膜含量的变化及相互关系,增加视网膜PEDF的含量重建二者之间的平衡,对于解释DR的发病机制及抑制DR的发展可能会起到重要的作用。
基因治疗是目前眼部血管和变性性疾病治疗的新途径。由于眼部具有解剖结构明确、屈光间质透明、易于注射等特点适于做为基因治疗的靶器官。重组腺相关病毒载体(recombinet adeno-associated virus rAAV)介导的基因产物在眼内的表达可持续150天。因而我们设想,如果能够利用rAAV载体介导PEDFcDNA眼内注射,使其转染视网膜细胞,并长期表达PEDF,就能够解决PEDF蛋白在体内不稳定,半衰期短,需要多次大量用药及重复眼内注射可能引起严重并发症多等诸多问题,对于阻止糖尿病性黄斑水肿(Diabetic macular edema,DME)和视网膜新生血管的发展所带来的视力损害可能会是一个有潜力的治疗策略,本课题拟在糖尿病大鼠模型基础上,通过玻璃体注射rAAV2-CMV-PEDF,转染视网膜细胞,观察PEDF基因及蛋白的表达及其对糖尿病大鼠视网膜的功能和形态的影响。
方法:
1、Wister大鼠,雄性,鼠龄10周,体重175~200g,空腹12h后,按60mg/kg的剂量腹腔一次性注射2%链脲佐菌素,48h后血糖>16.7 mmol/L者确定为糖尿病大鼠。成模大鼠分为1月(DM1),3月(DM3)及6月(DM6)三个观察时相。
2、雄性Wister大鼠随机分为正常对照组和糖尿病组。糖尿病组右眼玻璃体注射2μlrAAV2-CMV-GFP(1×1011 v.g/ml),左眼假注射。正常大鼠右眼假注射(CONf),左眼不注射。利用免疫组化法观察不同时期视网膜VEGF和PEDF含量变化和相互关系。利用荧光显微镜观察rAAV2转染视网膜细胞的表达部位及持续时间。
3、雄性Wister大鼠随机分为正常对照组(CON)和糖尿病组。正常大鼠右眼假注射(CONf),左眼不注射。糖尿病大鼠右眼玻璃体注射2μlrAAV2-CMV-hPEDF(1×1011 v.g/ml)作为治疗组(DMt),左眼玻璃体注射2μlrAAV2-CMV-GFP(1×1011 v.g/ml)作为自身对照。利用RT-PCR观察不同时期视网膜PEDF和VEGF的mRNA表达;利用Western blot观察不同时期视网膜VEGF、PEDF、ICAM-1和Occludin的蛋白表达;利用Evansblue法测定不同时期血-视网膜屏障渗漏情况。同时观察不同时期视网膜毛细血管的形态变化。
结果:
1、正常大鼠未注射眼视网膜无强荧光表达。rAAV2-CMV-GFP注射后1月时视网膜节细胞层表达强荧光,3月时视网膜全层和部分巩膜表达强荧光,6月时视网膜及巩膜全层表达强荧光,荧光强度与1月,3月时相比明显增加。
2、糖尿病大鼠视网膜VEGF蛋白水平显著升高,且随病程延长表达水平不断升高,至6月时与正常大鼠相比表达量增加了2倍,差异显著(P<0.01)。PEDF蛋白随时间推移,表达水平不断降低,至6个月时与正常大鼠相比表达量下降了一半,差异显著(P<0.01)。二者的表达水平呈显著负相关(r=-0.908,P<0.01)。
3、rAAV2-CMV-hPEDF玻璃体注射后视网膜hPEDFmRNA表达不断增强,持续到6个月,达到顶峰。PEDF蛋白表达亦不断增加,与同时期对照眼相比差异显著(P<0.01)。治疗眼组各时间点视网膜VEGFmRNA及蛋白表达量相互间无显著差异(P>0.05),均显著高于正常眼(P<0.05),但与同时期对照眼相比表达显著降低(P<0.01)。
4、糖尿病大鼠1月时视网膜微血管与正常视网膜微血管形态无明显差别,毛细血管管径粗细均一,走形规则。3个月时出现毛细血管纡曲,走行不规则,管腔粗细不一,内皮细胞及周细胞数减少,并出现无细胞毛细血管。6个月内皮细胞减少更明显,血管扭曲,形态改变严重,部分管腔成闭锁状,无细胞毛细血管增多。治疗眼3月组可见基本完整的血管网,视网膜毛细血管管径粗细基本一致。6个月组出现部分毛细血管纡曲,走行不规则,管腔粗细不一,内皮细胞减少不明显。
5、随糖尿病病程进展,视网膜渗漏不断增强,一直持续到6个月达到高峰。与正常相比,差异显著(P<0.01)。各治疗组与对照组相比视网膜渗漏减轻,其中DM1t视网膜Evansblue含量低于DM1,但统计学差异不显著(P>0.05)。DM3t及DM6t均显著低于DM3和DM6(P<0.05),但各治疗组与正常组相比Evans blue含量仍有显著增加(P<0.05)。
6、随糖尿病病程进展,视网膜ICAM-1蛋白含量不断增加,与正常相比均有明显差异(P<0.01)。治疗组与相应对照组相比,ICAM-1蛋白含量均显著下降(P<0.01),但与正常组相比仍有显著升高(P<0.01)。Occludin蛋白随糖尿病病程进展,含量不断降低,与正常组相比,差异显著(P<0.01)。治疗组DM1t与DM1相比Occludin蛋白含量无显著差异(P>0.05),DM3t,DM6t与相应对照组相比,Occludin蛋白含量均显著升高(P<0.01)。DM1t,DM3t与CONf相比仍有显著降低(P<0.05),但DM6t与CONf相比Occludin蛋白含量无显著差异(P>0.05)。视网膜ICAM-1与Occludin含量呈显著负相关(r=-0.754,P<0.01)。
结论:
1、糖尿病大鼠随病程进展视网膜VEGFmRNA和蛋白水平不断升高,其调节发生在mRNA水平。PEDF蛋白水平不断降低,二者呈显著负相关。
2、rAAV2-CMV-hPEDF玻璃体注射可长期、稳定增加糖尿病大鼠视网膜PEDFmRNA和蛋白水平,并抑制VEGF的表达,其调节在mRNA水平。
3、rAAV2-CMV-hPEDF玻璃体注射可改善DR早期视网膜微血管的损害。
4、rAAV2-CMV-hPEDF玻璃体注射可保护血-视网膜屏障,明显降低糖尿病大鼠血管渗漏。
5、rAAV2-CMV-hPEDF玻璃体注射可抑制糖尿病大鼠视网膜ICAM-1表达,并提高Occludin的表达。
6、rAAV2-CMV-hPEDF玻璃体注射对早期糖尿病视网膜病变损害有保护作用。