随着抗生素的广泛使用,耐药性问题日益凸显,寻找新的抗生素是解决这一问题的重要方法之一。植物抗菌内生菌能产生多种新的抗菌肽,不但可以帮助解决人类健康问题,也可以解决植物和动物健康问题。本实验室从中华芦荟中分离到一株植物内生菌A11,该菌株能产生抗枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌的多肽类抗生素,对许多种病源真菌也有不同程度的抗菌性,具有较广的抗菌谱。本实验室对植物内生菌A11抗菌活性物质产生前后的差异蛋白进行了质谱测定和分析,分析结果表明抗菌物质产生的同时噻唑合酶的表达大量增加。所以噻唑合酶可能在A11的抗菌活性的产生过程中发挥重要作用；同时本实验室也对A11进行了全基因组测序,并对基因组进行了注释。为阐明ThiG与植物内生菌A11抗菌活性的关系,我们锁定ThiG基因,对其进行分子生物学研究。本文围绕以下方面进行了研究： 1植物内生菌菌A11 ThiG敲除载体的构建 构建中间为卡那霉素抗性基因,两侧为ThiG编码基因上、下游同源序列的基因敲除质粒。根据文献和Genebank中已经登录的pet28a（+）载体的卡那霉素抗性基因Kar的基因序列设计引物和酶切位点,经过PCR扩增得到Kar,将其与pBluescriptⅡSK （+）载体连接,获得重组载体PBSK-k。根据植物内生菌A11全基因组测序分析,获得ThiG的上、下游基因序列Larm1和Rarm,设计引物进行PCR扩增,并将它们顺次与载体连接最终获得基因敲除载体PBSK-lkr,并将其重命名为PBSK-ThiG。 2植物内生菌A11噻唑合酶基因缺失突变株的构建及其抗菌活性检测 制备植物内生菌A11的感受态,通过电击法用已经构建的基因敲除载体PBSK-ThiG转化植物内生菌A11,并通过PCR鉴定、酶切验证获得噻唑合酶基因缺失突变株mA11。以野生株A11为对照,在相同的条件下进行发酵,以金黄色葡萄球菌为指示菌37℃恒温培养15小时,通过抑菌试验检测mA11的抗菌活性,以验证ThiG基因与植物内生菌A11的抗菌活性的产生是否有直接关系。结果表明敲除了ThiG基因并不影响其抗菌活性物质的产生。