苹果酸-乳酸发酵(MLF)是葡萄酒生产工艺中非常重要的发酵过程。MLF不仅改善了葡萄酒的口感、降低酸度,还有利于增强葡萄酒的稳定性并产生一些有利于改善葡萄酒质量的风味物质。然而到目前为止,人们对于MLF的认识还很不充分,许多问题有待解决。特别是苹果酸-乳酸发酵细菌(MLB)的一些研究方法尚未建立,使得有关MLF和MLB的研究相对滞后。本研究对具有潜在高酒精度的歌海娜葡萄原料进行了发酵分析,对自然MLF过程中细菌的多样性、分类鉴定、遗传多样性、细胞的快速计数方法、耐酒精能力等进行了研究,以期为更深入的认识和研究MLF及MLB奠定基础。(1)本研究首次建立了以Hind III和Mse I为内切酶的O.oeni扩增片段长度多态性分析技术(AFLP)体系,包括O.oeni AFLP分析的基因组DNA提取方法、Hind III和Mse I双酶切连接反应体系、预扩增和选择性扩增反应体系;分别研究了变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳两种AFLP扩增产物检测方法,比较了两种不同的毛细管电泳检测数据分析方法对分析结果的影响;对O.oeni AFLP分析的选择性扩增引物进行了筛选。研究结果表明:以Hind III和Mse I为内切酶的O.oeni AFLP分析方法扩增效率高、扩增结果稳定、试验结果重复性在98%以上;引物组合筛选结果表明:HT-MA、HT-MT、HT-MC、HG-MA、HG-MT、HC-MT为O.oeni AFLP分析的最佳引物组合。两种不同扩增产物检测结果表明:毛细管电泳检测快速简便,然而其信号检测、数据处理方法等有待进一步研究。(2)对22株筛选自我国不同葡萄酒产区的O.oeni进行了AFLP分析。结果显示:22株O.oeni分为三个簇群,且簇群间遗传相似性系数较小。表明中国葡萄酒产区的O.oeni具有丰富的遗传多样性,但O.oeni间的遗传相似性与其生态地理分布不完全相关。(3)研究对澳大利亚巴罗莎谷产区(Barrosa Valley)含潜在高酒精度的歌海娜葡萄原料进行了发酵研究,并利用纯培养的方法对MLF过程中的细菌进行了分离纯化和鉴定。结果显示:自然酒精发酵后的葡萄酒都能够完成MLF,而接种酒精发酵后的葡萄酒MLF非常缓慢或中途终止发酵,只有1/3能够完成MLF。从自然MLF过程中分离纯化出108株细菌,形态学、革兰氏染色、过氧化氢酶实验、16S r RNA测序和Species-specific PCR分析结果表明其中104株为O.oeni,3株为Lactobacillas hilgardii,1株为Staphylococcus pasteuri。(4)对澳大利亚葡萄酒产区O.oeni分离菌株的AFLP分析表明:104株O.oeni可分为6个簇群,且簇群之间的相似性系数较小(0.570~0.704)。这些菌株表现出较丰富的遗传多样性,说明同一MLF过程中也可能存在丰富的O.oeni基因型。但比较而言,中国不同葡萄酒产区分离的O.oeni菌株间遗传相似性更低,遗传多样性也更丰富。说明葡萄酒产区的不同即生态地理环境的差异会带来O.oeni基因型的较大差异。(5)本研究利用流式细胞仪结合Bac LightTM试剂盒染色对O.oeni和L.hilgardii的快速细胞计数进行了研究,结果表明:此方法对L.hilgardii的计数结果与稀释涂平板法的计数结果具有较好的相关性,而对O.oeni则没有相关性。表明此种方法可用于L.hilgardii的快速细胞计数而不适合用于O.oeni的快速计数。(6)根据AFLP的聚类分析结果,筛选出10株O.oeni和3株L.hilgardii分离菌株进行15、17和19%(v/v)三个梯度的耐酒精分析,结果显示:O.oeni G63、G46、G71、G39能在含17%(v/v)酒精浓度的MRS-AJ培养基中存活并生长,而对照的耐酒精商业菌株VP41则不能存活。O.oeni G63能在19%(v/v)酒精浓度条件下存活并生长168 h以上,显示出它们作为耐高酒精度MLF发酵剂的潜力。3株L.hilgardii分离菌株均能在19%(v/v)酒精浓度条件下存活并生长,表现出很高的耐酒精能力,显示出作为新一代MLF发酵剂的可能性。