小麦籽粒大小QTL鉴定及候选基因的克隆

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小麦是人类重要的粮食来源,对小麦产量相关性状进行数量性状基因座(QTL)鉴定,是进行候选基因克隆,解析其遗传基础的重要前提,也可为小麦分子育种提供理论及技术支持。本研究选用大粒小麦品系P271(母本)和小粒材料中国春(CS,父本)为亲本进行杂交,构建F2群体,利用SLAF测序技术构建高密度遗传图谱,对小麦粒长、粒宽、千粒重进行QTL定位。对候选区段进行功能注释和分析,筛选出对籽粒大小可能有调控作用的候选基因CYP78A5。通过对不同粒型中CYP78A5基因及启动子序列进行扩增,研究CYP78A5基因在不同粒型材料中的序列差异。采用实时荧光定量PCR技术对P271和CS的根、茎、叶、幼穗及籽粒发育过程中CYP78A5基因表达模式进行分析,并将候选基因转化拟南芥进行功能验证。结果如下:1.利用SLAF技术构建了P271/CS的F2群体高密度遗传连锁图谱。将筛选出的5,177个多态性标记定位在21条染色体上。覆盖的图谱总长度为3,170.61c M,标记间平均距离为0.87c M。通过QTL定位共筛选到9个控制粒长、粒宽、千粒重的主效QTL。其中1B上定位到1个控制千粒重的QTL;2A上检测到2个控制粒长、1个控制千粒重的QTL;2B上定位到控制粒长和千粒重的QTL各1个;4A上定位到1个控制粒长的QTL;7A上定位到1个控制粒长的QTL;7D上定位到1个控制粒宽的QTL。对QTL定位区间进行功能注释和候选基因预测,在2A和2B染色体上筛选到一个控制籽粒大小的候选基因CYP78A5。2.利用同源克隆的方法从大粒品系P271、2017VP074、2017P296和小粒材料CS、2015P24的2A、2B、2D染色体上克隆到Ta CYP78A5基因,2A、2B、2D染色体上Ta CYP78A5基因的编码区长度分别为1637、1637和1622bp。不同染色体上的Ta CYP78A5基因序列之间显示出98.06%的高度相似性,说明Ta CYP78A5基因在不同粒型的小麦中相对保守。Ta CYP78A5由2个外显子和1个内含子组成,含有保守结构功能域(疏水区、氧结合位点、亚铁血红素结合位点)。构建CYP78A家族的进化树,分析表明CYP78A5基因在进化过程中比较保守。3.预测并克隆CS和P271材料中Ta CYP78A5基因的启动子,结果发现CS和P271中2A和2D染色体上的启动子长度一致,分别2322bp和1876bp。但2B染色体上长度是不一致的,CS的启动子长度为2469bp,P271的启动子长度为2566bp。分析启动子元件的结构域发现CS和P271的各染色体上都含有重要的启动子结构域TATA-box、CAAT-box。P271的2B染色体上比CS多三个结构域,分别是ACE、Sp1、TCCACCT-motif。我们推测ACE和Sp1可能会和CS和P271小麦籽粒的差异有关。4.利用实时荧光定量PCR技术对Ta CYP78A5基因的表达模式进行分析。Ta CYP78A5基因在P271花前成株期的根、茎、叶、幼穗及籽粒发育的第15天前的相对表达量均不同程度的高于CS。P271的籽粒显著大于CS,可能是由Ta CYP78A5基因表达量的差异引起的,Ta CYP78A5的表达量对小麦种子大小形成有正相关作用。5.通过重组双元表达载体p CAMBIA-1302将Ta CYP78A5基因转化到拟南芥中过表达。阳性植株表现出生长延迟、叶片变得狭窄、花序顶端提前停止繁殖、果夹变粗、种子变大、种子的结实率降低。Ta CYP78A5基因过量表达能够促进种子增大。
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