【摘 要】
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禽呼肠孤病毒（Avian Reovirus,ARV）是家禽的重要病原之一,可引起病毒性关节炎、吸收障碍综合征、矮小综合征、呼吸道疾病和免疫抑制等疾病。ARV的传播方式复杂、对环境的抵抗力较强,使得防控有较大的困难。本研究通过探讨ARV的入胞途径,筛选入胞过程中的互作蛋白,分析宿主蛋白与ARV感染的关系,为阐述ARV致病机理提供参考。1.ARV通过小窝蛋白依赖型内吞途径入胞本研究采用蔗糖梯度离心纯化
【基金项目】
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国家自然科学基金青年基金项目（编号:31902250）； 江苏高校优势学科建设工程项目；
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禽呼肠孤病毒（Avian Reovirus,ARV）是家禽的重要病原之一,可引起病毒性关节炎、吸收障碍综合征、矮小综合征、呼吸道疾病和免疫抑制等疾病。ARV的传播方式复杂、对环境的抵抗力较强,使得防控有较大的困难。本研究通过探讨ARV的入胞途径,筛选入胞过程中的互作蛋白,分析宿主蛋白与ARV感染的关系,为阐述ARV致病机理提供参考。1.ARV通过小窝蛋白依赖型内吞途径入胞本研究采用蔗糖梯度离心纯化ARV GX/2010/1毒株,再以纯化的ARV GX/2010/1毒株分别感染Vero细胞和DF-1细胞,30 min后利用透射电镜技术观察病毒感染的细胞。结果发现,细胞膜表面存在形似“小窝”的凹陷小泡,还观察到被凹陷小泡半包裹、尚未入胞的病毒粒子和完全包裹、已经入胞的病毒粒子。为了进一步探究ARV的入胞途径,采用多种内吞途径抑制剂预处理Vero细胞和DF-1细胞,包括动力蛋白抑制剂Dynasore、网格蛋白抑制剂氯丙嗪和小窝结构抑制剂制霉菌素;然后以ARV GX/2010/1毒株感染预处理过的细胞,再采用RT-qPCR、Western Blot和瑞氏-姬姆萨染色分别从基因水平、蛋白水平和合胞体数量检测ARV的感染效率。结果显示,ARV入胞依赖动力蛋白和小窝,不依赖网格蛋白,表明ARV通过小窝蛋白依赖型内吞途径入胞。2.ARV σB蛋白与Caveolin-1脂筏蛋白存在互作关系通过蔗糖梯度密度离心和Western Blot技术,在感染ARV 1 h后的Vero细胞和DF-1细胞的脂筏组分中分离、鉴定到脂筏蛋白Caveolin-1和ARV σB蛋白;之后,又在感染ARV 12 h的脂筏组分中分离到脂筏蛋白Caveolin-1和少量的ARVσB蛋白、p10蛋白、p17蛋白和σNS蛋白。为了探究Caveolin-1和ARV σB的关系,在ARV感染Vero细胞和DF-1细胞30 min时,用间接免疫荧光技术（IFA）和激光共聚焦技术检测到Caveolin-1和σB存在空间共定位现象。分别构建pCDNA3.1-σB-Flag和pCDNA3.1-Cav-1-Myc真核表达载体,共转染Vero细胞和DF-1细胞,通过IFA和激光共聚焦技术发现σB-Flag和Cav-1-Myc在胞内具有亚细胞共定位现象。利用免疫共沉淀技术（CO-IP）验证了σB-Flag和Cav-1-Myc在胞内存在相互作用情况。以上结果显示,Caveolin-1和σB存在相互作用关系。为了进一步验证Caveolin-1对ARV复制的影响,用siRNA特异性敲低Vero细胞和DF-1细胞上的Caveolin-1基因,抑制Caveolin蛋白水平表达,用RT-qPCR技术检测病毒载量的变化。结果显示,当Caveolin-1基因被下调后,ARV在Vero细胞和DF-1细胞中的复制被显著抑制。综上所述,Caveolin-1在ARV内吞入胞过程中发挥重要作用,与ARV复制密切相关。
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