【摘 要】
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目的:探讨依维莫司（Everolimus,EVE）对膝关节术后纤维化的抑制作用及其可能的作用机制。方法:选取全膝关节翻修术的患者,切取膝关节内局部纤维化组织进行组织学染色和细胞鉴定。建立兔膝关节纤维化模型,麻醉后切开膝关节内侧皮肤,暴露股骨内侧髁,去除约1.0 × 1.0cm的骨皮质后,分别应用生理盐水和30ng/ml的EVE进行局部处理,术后4周获取膝关节内纤维化标本并制成石蜡切片,通过免疫荧光
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目的:探讨依维莫司（Everolimus,EVE）对膝关节术后纤维化的抑制作用及其可能的作用机制。方法:选取全膝关节翻修术的患者,切取膝关节内局部纤维化组织进行组织学染色和细胞鉴定。建立兔膝关节纤维化模型,麻醉后切开膝关节内侧皮肤,暴露股骨内侧髁,去除约1.0 × 1.0cm的骨皮质后,分别应用生理盐水和30ng/ml的EVE进行局部处理,术后4周获取膝关节内纤维化标本并制成石蜡切片,通过免疫荧光染色（IF-P）证实纤维化组织的主要组成细胞,通过HE染色观察EVE对兔膝关节术后纤维化形成的抑制作用,通过Masson染色和天狼星红染色观察EVE对兔膝关节术后纤维化组织内胶原沉积的影响。随后提取来源于人膝关节局部纤维化组织的成纤维细胞进行体外培养,分别用不同浓度的EVE进行处理细胞,通过CCK-8实验和流式细胞术检测EVE对成纤维细胞活力和凋亡的影响;使用LC3免疫荧光（IF）和透射电子显微镜（TEM）检测EVE对成纤维细胞自噬的影响;使用蛋白免疫印迹法（WB）检测EVE对细胞凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax 和 cleaved-PARP）、自噬相关蛋白（LC3、Atg5 和 Beclin-1）和 PI3K/AKT/mTOR 信号通路中相关蛋白表达的影响。为了探讨EVE激活成纤维细胞自噬与诱导其凋亡的潜在关系,应用细胞自噬抑制剂（3-MA）预处理,观察细胞自噬被抑制后,EVE诱导的成纤维细胞凋亡是否发生影响。结果:人膝关节纤维化组织的组织学染色结果显示局部有致密的纤维化形成和丰富的胶原组织沉积,IF-P结果证实该纤维化组织内含有大量的成纤维细胞。动物实验部分显示:IF-P证实兔膝关节局部纤维化组织的主要构成细胞为成纤维细胞,与人膝关节术后纤维化组织的主要构成细胞一致;HE染色结果证实EVE处理组膝关节手术区域的纤维化程度较对照组明显减轻;Masson染色和天狼星红染色显示EVE处理组膝关节手术区域的胶原含量较对照组明显减少。细胞实验部分:CCK-8结果显示EVE能够抑制成纤维细胞的活性;流式细胞术结果显示EVE能够增加成纤维细胞的凋亡率;WB结果显示EVE能够增加凋亡蛋白Bax和cleaved-PARP的表达,而减弱抗凋亡蛋白Bcl-2的表达;TEM检测结果显示EVE处理组细胞内的自噬小体数量较对照组明显增加;IF结果显示在应用EVE处理后,细胞核周围聚集了大量的绿色荧光,且随着EVE药物浓度增加而逐渐增加;WB结果显示EVE能够增加自噬相关蛋白（LC3、Atg5和Beclin-1）的表达。联合应用自噬抑制剂（3-MA）后,IF结果显示EVE处理后聚集在细胞核周围的绿色荧光减少,自噬相关蛋白（LC3、Atg5和Beclin-1）的表达下降;同时流式细胞术结果证实EVE上调的细胞凋亡率也发生下降,凋亡蛋白Bax和cleaved-PARP的高表达有所下降,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达升高。使用EVE处理成纤维细胞后能够下调p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达水平,而3-MA能够部分逆转EVE所下调的p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达水平。结论:成纤维细胞过度增殖是膝关节术后纤维化形成的因素之一,EVE能够抑制膝关节术后纤维化形成。EVE能够通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路激活自噬反应、诱导成纤维细胞凋亡,这可能是其抑制膝关节术后纤维化形成的分子机制。
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